香樟胚性愈伤组织诱导、增殖及抗寒性鉴定体系的建立

发布时间：2020-05-01 19:54

【摘要】：香樟(Cinnamomum camphora L.)具有较高的观赏价值、实用价值和文化价值,然而香樟树作为亚热带树种,其对低温的适应能力较差。提高香樟的抗寒性不仅可丰富我国北方地区风景树种,使其更好的发挥园林绿化价值,而且可使其更加健壮的生长减少经济损失,有利于香樟更好的发挥经济树种的优势。提高香樟抗寒性最有效的方法是选育抗寒新品种,而抗寒基因的挖掘是抗寒育种的关键,本实验室前期已从香樟中分离获得4个抗寒相关CcCBF基因,欲在香樟中研究CcCBFs基因功能,然而,由于木本植物本身的特殊性,使其遗传转化和再生周期较长,通过获得转基因香樟植株研究CcCBFs基因功能不切实际。因此,发掘快速准确基因功能研究材料,具有重要意义。香樟胚性愈伤组织质地坚实,呈嫩黄色球形颗粒状,由等直径细胞组成,其原生质浓厚分裂活性较强,且具备胚胎发生能力,可形成体细胞胚。早期研究发现,以香樟胚性愈伤组织作为受体,能获得较理想的转化效果。因此,香樟胚性愈伤组织可能是基因功能验证的好材料。本研究首先利用组培技术,优化香樟胚性愈伤组织诱导、增殖体系;然后,以香樟胚性愈伤组织为试材,从分子和组织水平综合分析其感知低温胁迫能力,筛选获得其受低温胁迫最强烈的时刻和生理指标,从而建立香樟胚性愈伤组织抗寒性鉴定体系,以期后续用于鉴别不同转基因材料的抗寒性。本研究主要成果如下:1.香樟胚性愈伤组织诱导、增殖体系的优化香樟体胚的诱导获得:以香樟未成熟果实为外植体,探究外植体消毒方法、外植体采样时期、植物生长调节剂组合及水解酪蛋白浓度,对香樟体胚诱导效果的影响。结果显示,1%次氯酸钠消毒处理25 min时消毒效果较为理想;7月下旬收获的新鲜外植体体胚诱导率,高于8月上旬与8月中旬体胚诱导率;植物生长调节剂6-BA与2,4-D的合理添加(1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D),有利于香樟体胚的诱导获得;水解酪蛋白的添加对香樟体胚的诱导发生具有促进作用,当水解酪蛋白浓度为750 mg/L时,其体胚诱导率相对较高。本研究获得的较适宜诱导配方为D4:MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+0.8%琼脂+3%蔗糖+750 mg/L水解酪蛋白,其体胚诱导率为63.3%。香樟体胚的增殖:将诱导获得的香樟体胚,及时更换至新鲜培养皿D4中(每2周继代保存一次),可保持较高的增殖效率,且增殖获得的体胚具有较强的活力。本研究共筛选获得3个香樟体胚无性系,分别命名为SE1、SE3和SE5。香樟胚性愈伤组织的诱导获得:以增殖获得的具有相同激素来源的香樟体胚SE3无性系为试材,探究植物生长调节剂组合及蔗糖浓度,对香樟胚性愈伤组织诱导效果的影响。结果显示,当2,4-D与6-BA比值为8(4.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA)时,胚性愈伤组织的诱导率相对较高为18.3%,其次为2,4-D与6-BA比值为12(6.0mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA)时,诱导率为13.3%;当蔗糖浓度为5%时,胚性愈伤组织诱导率为28.3%,且诱导获得的胚性愈伤组织活力较强,呈嫩黄色紧致状。可知,2,4-D在香樟胚性愈伤组织的诱导过程中起主导作用,适宜的蔗糖浓度有利于胚性愈伤组织状态的调整,本研究中较适宜的胚性愈伤组织诱导配方为F3:MS+0.5mg/L 6-BA+4.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L Vc+0.8%琼脂+5%蔗糖+1000 mg/L水解酪蛋白,诱导率为28.3%。香樟胚性愈伤组织的增殖:以诱导获得的胚性愈伤组织为试材,探究植物生长调节剂组合、水解酪蛋白浓度及继代频率,对香樟胚性愈伤组织增殖效果的影响。结果显示,随着6-BA和2,4-D质量浓度的增加,香樟胚性愈伤组织增殖率呈现先增后减的趋势,植物生长调节剂在1.5 mg/L 6-BA与0.15 mg/L 2,4-D浓度组合时,出现峰值,此时的胚性愈伤组织的增殖率相对较高;水解酪蛋白的添加有利用香樟胚性愈伤组织的增殖;适当提高继代频率有利于香樟胚性愈伤组织的保存与增殖,每7天继代一次其活力和增殖能力均较强。本研究获得的较适宜增殖配方为J5:MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L 2,4-D+0.8%琼脂+3%蔗糖+1000 mg/L水解酪蛋白;继代频率为:每7天更换继代培养皿一次。此外,本研究共筛选获得4个香樟胚性愈伤组织无性系,分别命名为EC1、EC3、EC5和EC8。2.香樟胚性愈伤组织抗寒性鉴定体系的建立以香樟胚性愈伤组织EC5无性系为试材,采用荧光定量PCR技术,分析CcCBFs在4℃低温胁迫下的表达情况,结果发现:胁迫处理1 h时CcCBFs相对表达量均显著高于对照(0 h),随胁迫时间延长CcCBFs相对表达量呈先升后降的趋势,且在胁迫处理24 h其相对表达量极显著增加达到峰值。以香樟胚性愈伤组织EC5无性系为试材,探究其在4℃低温胁迫下的生理、生化指标变化情况。结果发现,脯氨酸和可溶性糖含量均随胁迫时间的延长,呈先升后降的趋势,分别于胁迫处理8 h和2 h出现峰值;丙二醛含量随胁迫时长的增加,呈先降低后升高的趋势,于胁迫12 h出现低峰;SOD和CAT活力均随胁迫时间的延长,呈先升后降的趋势,分别于胁迫处理12 h和8 h出现峰值。结果表明,香樟胚性愈伤组织在经受4℃低温胁迫后,其生理、生化指标能够呈现一定变化趋势,因此该材料可在细胞水平上感知4℃低温胁迫。以香樟胚性愈伤组织EC5无性系为试材,探究其在-4℃低温胁迫下的生理、生化指标变化情况。结果发现,脯氨酸和可溶性糖含量均随胁迫时间的延长,呈先升后降的趋势,分别于胁迫处理8 h和2 h出现峰值;丙二醛含量随胁迫时长的增加,呈先降低后升高的趋势,于胁迫2 h出现低峰;CAT和POD活力均随胁迫时间的延长,呈先升后降的趋势,分别于胁迫处理8 h和2 h出现峰值。结果表明,香樟胚性愈伤组织在经受-4℃低温胁迫后,其生理、生化指标能够呈现一定变化趋势,因此该材料可在细胞水平上感知-4℃低温胁迫。本研究建立香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法,当脯氨酸、可溶性糖含量相对较高,SOD、CAT和POD活力相对较强,MDA含量相对较低时,则对应的香樟胚性愈伤组织的抗寒性相对较强;反之,则相对较弱。本研究不仅证实了胚性愈伤组织可以作为鉴定香樟抗寒性的良好材料,而且揭示了香樟胚性愈伤组织在低温胁迫下CcCBFs表达模式以及各生理、生化指标变化规律,筛选获得该材料响应低温胁迫较敏感的生理指标和最剧烈的时刻。4℃下筛选获得的抗寒性鉴定指标主要包括:可溶性糖、脯氨酸、SOD、丙二醛和CAT,其对应的具有研究价值的时刻分别为:2 h、8 h、8 h、12 h、12 h。-4℃下筛选获得的抗寒性鉴定指标主要包括:可溶性糖、丙二醛、POD、脯氨酸和CAT,其对应的具有研究价值的时刻分别为:2 h、2 h、2 h、8 h、8 h。
【图文】：

香樟,体胚,体胚诱导

其体胚诱导率均大于 60%，表明此浓度范围有利于香樟未成熟合子胚诱导获得体胚（如图3-1 所示）。表 3-4 不同水解酪蛋白浓度对香樟未成熟合子胚诱导体胚的影响Table 3-4 Effects of different hydrolyzed casein concentrations on somatic embryos induced byimmature zygotic embryos of C. camphora试验编号外植体数量（个）CH（mg/L）体胚诱导率（%）D 1 60 0 48.3D 2 60 250 53.3D 3 60 500 60D 4 60 750 63.3D 5 60 1000 61.7D 6 60 1250 58.3D 7 60 1500 58.3D 8 60 1750 55D 9 60 2000 56.73.1.5 小结香樟体胚的诱导试验结果表明，外植体消毒方式、外植体采样时期、植物生长调节剂组合以及水解酪蛋白浓度，均影响香樟未成熟合子胚诱导体胚的效果。分析研究结果可知：1%的 NaClO 较适合作为香樟未成熟果实的表面消毒剂，，消毒处理25 min 时消毒效果较为理想；7 月下旬为香樟体胚诱导试验的适宜取样时间段，此时间段采摘的香樟未成熟果实较易诱导获得体胚；复合配方 MBD 的诱导效果相对较好；当水解酪蛋白浓度为 750 mg/L 时，其体胚诱导率相对较高。综合分析可知

体胚,香樟

图 3-1 香樟体胚的诱导获得1.香樟未成熟果实；2.香樟未成熟合子胚；3.诱导获得的体胚Fig 3-1 Somatic embryos induced by immature zygotic embryos of C. camphora1. Immature fruit; 2. Immature zygotic embryo; 3. Somatic embryo..2 香樟体胚的增殖将上述研究中诱导获得的香樟体胚，置于增殖培养皿 D4（MS+1.0 mg/L 6-BA+.1 mg/L 2,4-D+0.8%琼脂+3%蔗糖+750 mg/L 水解酪蛋白）中，暗培养 1 周后即可察到体胚体积膨大，2～3 周后可观察到体胚大量增殖的现象，同时在增殖培养过中可观察到部分体胚萌发的现象（图 3-2 所示）。
【学位授予单位】：南阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S792.23

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