巴西橡胶树胶乳转化酶与14-3-3蛋白的互作研究
发布时间：2020-05-06 20:32
【摘要】：橡胶树胶乳转化酶属于中碱性转化酶,以蔗糖为唯一底物,是决定产胶细胞乳管蔗糖代谢活性的关键酶,其酶活调控与胶乳产量形成密切相关。在课题组的前期研究中,已证明HbNIN2是主要的胶乳转化酶编码基因,其基因的表达和酶活调控与割胶和乙烯刺激产胶密切相关。为进一步研究HbNIN2酶活的分子调控,笔者以HbNIN2为诱饵,利用酵母双杂交筛选其互作蛋白,并研究互作蛋白对其酶活的调控模式。取得的主要结果如下:1、成功构建了橡胶树胶乳均一化cDNA文库,并以HbNIN2为诱饵,利用酵母双杂交筛选到多个候选互作蛋白,其中14-3-3蛋白占阳性克隆总数的43. 8%;2、利用蓖麻、杨树、拟南芥等物种的14-3-3蛋白序列,搜索橡胶树转录组和基因组数据库,克隆得到14个橡胶树14-3-3蛋白基因(HbGF14-1～HbGF14-14),分别属于ε和non-ε两个亚型;3、酵母双杂交验证结果表明,14-3-3蛋白仅与主要的胶乳转化酶HbNIN2存在明显互作,而不与其它四个在胶乳中表达的HbNIIN蛋白发生互作;4、利用原核(大肠杆菌)表达系统,表达并纯化出大量带有组氨酸标签的可溶性14-3-3蛋白,以及具有酶活的HbNIN2蛋白。活性测定结果表明,在11个同HbNIN2互作的14-3-3蛋白中,HbGF14-l和HbGF14-12能显著增强HbNIN2的活性;5、利用真核(毕赤酵母)表达系统,诱导表达出带有组氨酸标签的HbNIN2蛋白,具有较强的酶活,并进一步利用饱和硫酸铵沉淀获得大量HbNIN2活性蛋白。活性测定结果表明,在11种同HbNIN2互作的14-3-3蛋白中,仅HbGF14-l能显著增强 HbNIN2 的活性,却有六种(HbGF14-2、HbGF14-4、HbGF14-9、HbGF14-10、HbGF14-13 和 HbGF14-14)显著抑制 HbNIN2 的酶活。本文研究,首次系统筛选HbNIN2的互作蛋白,并研究主要互作蛋白(14-3-3)基因家族对原核和真核表达的HbNIN2重组蛋白的活性调控。相关结果,为深入研究胶乳转化酶活性调控的分子机理奠定了良好基础,有助于揭示乳管蔗糖代谢和胶乳再生调控的分子机制,也为通过分子改良手段提高橡胶树胶乳产量提供理论依据,兼具理论意义与应用前景。
【图文】：
３．邋１．邋１胶乳ＲＮＡ的提取与检测逡逑采用本实验室改良的胶乳ＲＮＡ提取方法（Ｔａｎｇｅｔａｌ．，２００７），提取胶乳ＲＮＡ。逡逑如图３．１所示，分别取叫经Ｄ巧Ｃ水稀释１０００倍的胶现ＲＮＡ，汲！）得胶s痈鲋馗村义系模盎，
本文编号：2651823
【图文】：
３．邋１．邋１胶乳ＲＮＡ的提取与检测逡逑采用本实验室改良的胶乳ＲＮＡ提取方法（Ｔａｎｇｅｔａｌ．，２００７），提取胶乳ＲＮＡ。逡逑如图３．１所示，分别取叫经Ｄ巧Ｃ水稀释１０００倍的胶现ＲＮＡ，汲！）得胶s痈鲋馗村义系模盎，
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