橡胶树白粉菌Hog1信号途径相关基因的克隆及OhPbs2与OhCdc42功能分析

发布时间：2020-05-12 22:44

【摘要】：由橡胶粉孢(Oidium heveae B A. Steinmann,O. heveae)侵染导致的白粉菌是我国橡胶树的最重要病害,其导致严重的干胶产量损失。O. eveae为专性寄生菌,不能直接进行遗传转化操作,故而其致病分子生物学研究基础迄今比较薄弱,可利用的资料很少。Hog1信号途径在真菌细胞中广泛存在。该途径是生物体适应高渗逆境所必需的,也可能与O.heveae适应寄主环境有关。本研究从筛选获得的13个Hog1信号途径相关基因中,选取有代表性的OhPbs2和OhCdc42基因,通过同源克隆和原生质体转化等技术,分别借助橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides,C.gloeosporioides)和稻瘟菌(Magnaporthe grisea,M.grisea)鉴定这两个基因的功能,为阐明O.heveae对橡胶树的致病分子机理提供基础资料。主要研究结果如下:1.克隆到13个与Hog1途径相关的基因。在O. heveae基因组测序基础上,通过NCBI比对,采用同源克隆的方法,用Primer 5.0设计引物后克隆,得到13个Hog1途径相关基因,分别命名为:OhHog1、OhPbs2、OhSte11、OhSte50、OhSte20、OhCla4、OhBem1、OhCdc42、OhOpy2、OhYpd1、OhSsk1、OhSsk2/22、OhSho1。2.预测和验证了OhPbs 基因的功能。利用生物信息学分析方法进行氨基酸序列比对并构建系统进化树,预测OhPbs2基因编码蛋白为Pbs2,其功能与菌丝生长、细胞壁完整性、氧化压力传导和高渗透压甘油合成等生理生化过程有关。通过同源重组和原生质体转化技术将O.heveae 的OhPbs2基因转化到C.gloeosporioides的Pbs2基因缺失突变体△CgPbs2的基因组中,获得互补转化子△CgPbs2+OhPbs2。表型比对结果表明:△CgPbs2不能在高渗透压的培养基(1.5M山梨醇的PDA平板)环境下生长,而△CgPbs2+OhPbs2则能正常生长,表明适应高渗透压环境确实是OhPbs2基因的功能之一;在常规培养基、较高浓度的H2O2、较高浓度的SDS (十二烷基硫酸钠)以及杀菌剂咯菌腈的环境中,△CgPbs2+OhPbs2的生长发育表现均与C. gloeosporioides和△CgPbs2有明显差别,表明OhPbs2基因具有调控C. gloeosporioides生长发育、对氧化应激的反应、菌丝细胞壁发育、抵抗杀菌剂逆境等功能;对橡胶树叶片的致病力测定结果表明:C.gloeosporioides、△CgPbs2和△CgPbs2+OhPbs2均能诱发叶片出现典型炭疽病病状,但 C. gloeosporioides 比△CgPbs2 和△CgPbs2+ OhPbs2 诱发更重的病害,而△CgPbs2与△CgPbs2+OhPbs2的病害严重程度无显著差别,表明OhPbs2对C. gloeosporioides致病力的正调控能力不如CgPbs2。3.预测和验证了OhCdc4 基因的功能。利用生物信息学分析方法进行氨基酸序列比对并构建系统进化树,预测OhCdc42基因编码的是与稻瘟菌类似的Cdc42蛋白,功能与MAPK信号途径有关。利用同源重组和原生质体转化技术,将OhCdc42转化到缺失Cdc42的M. grisea突变体△MgCdc42中,获得互补转化子△MgCdc42+OhCdc42。表型比对结果表明:在常规培养基、高渗透压以及较高浓度的H2O2等环境下,△MgCdc42+OhCdc42能长出基本正常的菌落,而Mgrisea突变体△MgCdc42则只能长出微弱的菌落,且前者的菌落大小显著大于后者,表明OhCdc42基因参与调控病原菌菌落颜色,且与病菌的渗透压力和氧化压力传导、抵抗杀菌剂逆境等有关;在较高浓度的SDS的环境中,△MgCdc42+OhCdc42的生长发育表现均与M.grisea和△MgCdc42没有明显差异,但也能够部分恢复稻瘟菌耐受SDS的能力。对水稻叶片的致病力测定结果显示:M.grisea、△MgCdc42和△MgCdc42+OhCdc42均能诱发水稻品种C039产生典型的稻瘟病病斑,△MgCdc42+OhCdc42诱发的病害严重程度与M.grisea无差别,但两者均显著高于△MgCdc42诱发的病害,据此推断,OhCdc42基因在病原-寄主互作关系中,由于在信号传导途径中发挥作用而正调控了病原菌的致病力。4.分析比对了来自不同地点O.heveae的OhPbs2和OhCdc42基因。分别从海南3个橡胶树种植地点收集O.heveae,提取DNA,克隆OhPbs2和OhCdc42基因并测序,对序列信息进行生物信息和进化表达分析。结果表明:来自不同地点的OhPbs2和OhCdc42基因,在保守区域不存在明显差异。
【图文】：

信号通路,酿酒酵母,信号途径

并通过一系列信号途径将信号最终传递给转录因子，激活效应蛋白表达并产生相应答反应（Ｋｕｍａｍｏｔｏ，２００８）。逡逑在真核生物体内存在着许多既彼此独立又相互协作的复杂信号网络，保证生能够感受到外界环境中的变化同时迅速得做出正确的应答反应（Ｊｕｎｔｔｉｌａｅｔａｌ．，２００８）在这复杂的信号网络中，有一些普遍存在于生物体内且十分保守的信号途径。其ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ邋ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅｓ）信号途径主要是通过丝／苏氨酸蛋白激酶的酸化来调节生物体内复杂的生理功能。ＭＡＰＫ信号途径是由ＭＡＰＫＫＫ邋（ＭＡＰ邋ｋｉｎａｋｉｎａｓｅ邋ｋｉｎａｓｅ）、ＭＡＰＫＫ邋（ＭＡＰ邋ｋｉｎａｓｅ邋ｋｉｎａｓｅ）和邋ＭＡＰＫ邋（ＭＡＰ邋ｋｉｎａｓｅ）组成的级联激酶号途径，ＭＡＰＫＫＫ－ＭＡＰＫＫ－ＭＡＰＫ是依次被激活的（Ｌｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２）。激活的ＭＡＰ进一步激活下游的转录因子以及其它效应蛋白，最终生物体对外界特定的环境信号出正确的应答反应。ＭＡＰＫ信号途径之间也是既彼此独立又相互协作的。在植物原真菌中，ＭＡＰＫ信号通路参与了有性生殖、环境胁迫应答、维持细胞壁完整性致病力等方面的调控（Ｈａｍｅｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１２）。逡逑ＰｈｅｒｏＴ＾ｏｎｅｓ逦Ｎｕｔ＂？ｅｎｔ逦Ｈｉｇｈ邋ｏｓｎｏ邋ａｒｉｔｙ逦Ｃｅｌｌ邋ｗａｉｌ邋ｓｔｒｅｓｓ逡逑

橡胶树,信号途径,基因

孙雅琦将橡胶树白粉菌基因组数据库和小麦白粉菌ＱＢｌｔｍｅｒｉａｇｍｍＭｓ）同源序逡逑列比对，获得２５个ＭＡＰＫ信号途径相关基因。利用蛋白质结构域及聚类分析构建橡逡逑胶树白粉菌中的ＭＡＰＫ级联途径简图（图３），Ｆｕｓ３ａｎｄＫｓｓｌＭＡＰＫ信号途径有５逡逑个基因，Ｈｏｇｌ邋ＭＡＰＫ信号途径有５个基因，其中Ｓｔｅ邋１１、Ｓｔｅ邋５０、Ｃｄｃ邋４２在两条途径逡逑中都起作用，属于功能冗余现象。Ｓｔｉｌ（Ｍｐｋｌ）ＭＡＰＫ信号途径有６个基因，胞外激逡逑发ＭＡＰＫ反应有５个基因（孙雅琦等，，２０１５）。逡逑通过实时荧光定量分析，了解ＭＡＰＫ相关基因在侵染阶段的表达差异情况。结逡逑合橡胶树白粉菌在ｐａｒａｆｉｌｍ表面培养０－２４ｈｐｉ（ｈｏｕｒｓ邋ｐｏｓｔ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）的侵染发育可大致逡逑归纳为未萌发（Ｏｈｐｉ）、萌发（４ｈｐｉ）、附着胞形成（６、８ｈｐｉ）和次生附着胞（１６、逡逑２４ｈｐｉ）等４个形态发育阶段，研宄发现ＭＡＰＫ途径的Ｆｕｓ３邋ａｎｄＫｓｓｌ邋ｐａｔｈｗａｙ在芽管逡逑生成时发挥主要作用；Ｍｅｋｌ、Ｂｋｋｌ、和奶Ｍ在附着胞形成过程中起主要作用；逡逑在吸器和菌丝形成时，ＭＡＰＫ途径中的Ｈｏｇｌ邋ＭＡＰＫ邋ｐａｔｈｗａｙ起主要作用（孙雅琦，逡逑２０１５）。逡逑用ＭＡＰＫ信号途径特异性外源抑制剂－Ｕ０１２６处理，促使橡胶树白粉菌在非诱导逡逑琼脂表面萌发并形成附着胞。研宄发现ＭＡＰＫ途径相关基因参与了邋Ｏ．邋ｈｅｖｅａｅ的萌发逡逑过程（孙雅琦
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S763.7

【参考文献】