杨树和柳树微卫星特征分析及通用引物开发

发布时间：2020-05-23 20:35

【摘要】：微卫星(SSR)具有共显性、多态性高、易检测等优点,是一种广泛应用的分子标记技术。本研究以杨树和柳树的基因组为研究对象,对柳树全基因组SSR标记进行开发,为柳树的分类、遗传多样性和进化研究提供了丰富的资源。结合杨树全基因组SSR标记,分别对杨、柳的旁系同源基因和直系同源基因上的SSR标记序列进行分析,揭示杨、柳分化后基因组的进化趋势。另外,通过已发表的杨树SSR引物数据库寻找杨、柳基因组的通用引物,为建立杨、柳大遗传系统奠定基础。主要研究结果如下:1.簸箕柳全基因组共检索到完全微卫星109972个,平均4799bp出现一个完全微卫星,在基因间隔区、内含子区、外显子区和UTR区微卫星出现的频率分别为:72.8%、19.2%、4.2%和3.8%。对不同类型的微卫星的出现频率进行统计发现:重复单元长度越长,其微卫星含量越少,而重复单元越短的微卫星,获得重复单元的速度越快。在柳树基因组中,不同类型微卫星出现的频率并不是随机的,其GC含量与功能具有显著性相关。2.将全基因组分为174个窗口,通过划窗的方法,利用泊松分布检验Exonic_SSR在柳树基因组中的分布情况。结果显示67个窗口内的SSR分布密集,27个窗口内的SSR分布稀疏。SSR分布密集和稀疏的染色体体分别为16号和11号。但密集窗口的总碱基数只占全基因组的11%,而分散窗口的总碱基数达到基因组的55%,由此可见,Exonic_SSR在基因组中并不是均匀分布的,在基因组同源片段中Exonic_SSR大量变异。利用primer3软件对柳树基因区的SSR进行引物设计,为柳树的进化、分类和遗传多样性研究提供了丰富的资源。3.分别对杨树和柳树旁系同源基因中的SSR标记进行比较分析,发现杨树和柳树的旁系同源基因主要来源于杨柳科全基因组复制事件,在进化过程中柳树较杨树丢失了更多的基因,SSR的变异幅度也较大,说明杨树和柳树分化之后,杨树的基因组较柳树的基因组稳定。4.对杨树和柳树直系同源基因内的SSR序列进行比较,发现超过50%的SSR只在一个物种中存在。对这些SSR重复单元进行分析,发现A/T组成的重复单元居多,这与杨柳基因组及CDS区SSR的特点一致。二者GC含量平均值均为0.22,低于杨树和柳树CDS区域中SSR位点的GC含量,因此,直系同源基因中的微卫星不稳定,将导致同源基因继续分化。5.通过对毛果杨SSR引物数据库和簸箕柳基因组序列进行BlastN比对,获得杨柳的通用引物8462对。根据引物的对应的序列类型将引物分为三类:(1)通用引物对应的柳树序列中不存在SSR;(2)通用引物对应的柳树序列中存在SSR,且与杨树SSR重复序列一致;(3)通用引物对应的柳树序列中存在SSR,但与杨树SSR重复序列不同。随机选取40对引物在24个簸箕柳自然群体中进行PCR扩增,其中36对引物(90%)扩增成功,结果表明杨树的SSR引物在柳树中具有很高的通用性。对含有SSR序列的第二类和第三类引物进行PIC多态性检验,其中22对(29,75.8%)引物具有多态性,平均PIC分别为30.00%和39.80%,平均每对SSR引物检测到3.42和3个等位基因,每个SSR引物可检测到的等位基因数目为2~7和1~4个不等,共检测出了71个等位基因。
【图文】：

柳树,基因组

图 3-1 柳树基因组中外显子 SSR的分布Fig.3-1 The distribution of exonic SSR in the willow’s gene regions注：最左边的竖线表示实际长度，单位Mb；图中，每条染色体对应着两个柱形图，左边柱形图表示同种颜色为簸箕柳基因同源区域（白色区域无同源关系）；右边的柱形图显示外显子 SSR 在染色体中的实际位置。3.2.2 柳树基因区 SSR 引物设计利用 Primer 3.0 软件对柳树基因区的 SSR 位点进行批量设计引物，对每个 SSR 位点成功设计出 4 对引物（SSR 位点总数为 29850 个）以供选择，对应的左右序列、TM 值以及GC 含量都在表中显示。3.3 讨论通过收集到的簸箕柳基因区中外显子 SSR 信息，并利用泊松分布检验对其在染色体中分布的疏密情况，这与柳树全基因组微卫星在染色体中的分布（第二章）情况相似。为了更细致地知晓柳树染色体上的 exonic_SSR 分布，采用活动的“窗口大小”进行检测。李等[98]利用毛果杨的公共数据信息做了关于 exonic_SSR 在杨树中的特征分析的研究，更好通过 SSR 的变化，对基因的功能变化做出判断。杨树的同源基因中 SSR 的分布与柳树的结

序列,旁系,同源基因,基序

第二类中不变 SSR 的基因所含比例分别高于第三类和第四类，也就是说杨树中不变 SSR 基因数量的比例要比柳树要高，以说明杨树中的 SSR 更加保守，所程中也保留了下来。对每条染色体 SSR 不变的同源基因的基因数分别统计发现，参与过全基因组复树一号染色体（所含序列碱基数最多的染色体）所含不变 SSR 的基因数不是最据占总基因数的比例，含有量的是最少的。在杨树中未见此类情况，，每条染色的同源基因数与所在染色体的长度线性相关。.3 SSR 不变的旁系同源基因中 SSR 类型和基序长度分析表 4-3 中对不变 SSR 重复单元的长度进行了统计分析，结果如下。从SSR 基序第一类中以单碱基重复SSR（53.4%）的含量最高，其次为二碱基重复 SSR（37类中仅含有单碱基重复（41.3%）和二碱基重复SSR（58.7%），第三类则以三R（37.6%）居多，其次为二碱基重复 SSR（30.1%），第四类中二碱基重复 SSR（最高。从 SSR 类型来看，第一类中以单碱基重复（T）n（27.1%）含量最高，）n（18.6%）的 SSR；第二类中是以（AT）n的 SSR 所占比例最高，38.1%；四类也是以（AT）n的SSR占绝对优势，分别占各类中不变SSR总数的20.8%和
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S792.11;S792.12

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