转录因子AREB1与组蛋白修饰H3K9ac协同调控毛果杨应答干旱胁迫的机制研究

发布时间：2020-06-13 13:42

【摘要】：林木在多年生的次生生长过程中,会受到各种不同的外界环境条件的制约。其中,干旱是重要环境限制因子之一,对林业生产和自然生态系统构成全球性威胁,严重影响森林生物量与生产力。转录因子和组蛋白修饰在调节植物适应干旱胁迫中发挥关键的调控作用,但是二者之间如何相互协调控制耐旱基因表达的机制尚不清楚。林木主要利用木质部将从土壤中吸收的水分运输到地上部分的叶等器官。木质部是研究树木次生生长适应干旱胁迫的独特生物系统。因此,本研究以毛果杨(Populustrichocarpa)的木质部为对象,开展了 AREB1转录因子和组蛋白乙酰化修饰协同控制耐旱基因表达分子机制的研究。采用染色质免疫共沉淀结合高通量测序(ChIP-seq)和转录组高通量测序(RNA-seq)技术分别测定了毛果杨木质部在干旱胁迫下的组蛋白3第9位赖氨酸乙酰化修饰(H3K9ac)图谱和转录组。整合分析ChIP-seq和RNA-seq数据,结果发现干旱胁迫后H3K9ac水平显著增加的基因,转录被激活;H3K9ac水平下降的基因,转录被抑制,表明H3K9ac组蛋白修饰参与调控杨树应答干旱胁迫的基因表达。转录调控元件富集分析发现,AREB1(ABA-Responsive Element Binding 1)蛋白结合的 ABRE(ABA-Responsive Element)元件在H3K9ac修饰发生改变的干旱胁迫应答基因启动子上发生明显的富集,表明ABRE元件可能介导H3K9ac修饰对这些基因的调控。本研究鉴定出了76个H3K9ac修饰发生改变且含有ABRE元件的干旱胁迫应答转录因子基因,由其中选了三个基因(PtrNAC006、PtrNAC007、PtrNAC120),并获得了它们的过表达转基因毛果杨。表型分析显示,过量表达PtrNAC基因降低毛果杨木质部导管内腔孔径,增加木质部导管数量,并且增强转基因植株耐旱能力,推测PtrNAC基因可能通过影响次生木质部发育,改变导管的结构和数量,从而使杨树次生生长适应干旱胁迫。ChIP-seq和ChIP-qPCR结果显示,随着干旱程度的逐渐增加Ptr 基因启动子上ABRE元件区域的H3K9ac富集水平增加,表明ABRE元件参与H3K9ac调控PtrNAC基因对干旱胁迫的应答。RNA-seq与RT-qPCR结果显示,AREB1转录因子基因与组蛋白乙酰化酶复合体基因 GCN5(GENERAL CONTROL tNON-DEREPRESSIBLE 5)、ADA2b(ALTERATION/DEFICIENCY IN ACTIVATION 2)受干旱胁迫诱导呈现上调表达。Pull-down体外实验和双分子荧光互补(BiFC)体内实验证实AREB1、GCN5、ADA2b蛋白之间相互作用形成蛋白三聚体。获得了 PtrGCN5-1、PtrAREB1-2的抑制表达转基因毛果杨植株及PtrADA2b-3的CRISPR突变体植株。ChIP-qPCR与RT-qPCR分析显示,转基因毛果杨及突变体植株干旱胁迫后,H3K9ac、RNA聚合酶Ⅱ的富集水平和PtNAC基因的转录水平均显著下降,并且转基因植株与突变体耐旱性降低。此外,前期研究结果显示AREB1转录因子能够结合ABRE顺式作用元件并上调PtrNAC基因表达。综合以上结果,表明转录因子AREB1通过与GCN5、ADA2b相互作用将组蛋白乙酰化酶复合体招募到PtrNAC启动子上,引起PtrNAC基因H3K9乙酰化激活其表达,从而启动PtrNAC介导的抗旱基因网络,调节杨树适应干旱胁迫。综上所述,本研究明确了毛果杨中转录因子AREB1和组蛋白乙酰化酶复合体GCN5-ADA2b之间的相互作用关系及其对共同靶基因的调控作用,揭示了转录因子与表观遗传修饰协同调控杨树次生生长适应干旱胁迫的分子机制,为利用分子育种技术进行林木高抗育种提供了理论基础。
【图文】：

图１－１技术路线逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．邋１－１邋Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ邋ｒｏｕｔｅ逡逑

迫影响下Ｈ３Ｋ９ａｃ差异结合的基因。首先，对３个月的毛果杨温室苗进行了干旱胁迫的逡逑处理，然后在同一时间点分别收集了正常浇水（ＮＤ）、干旱胁迫５天（Ｄ５）、干旱胁迫逡逑７天（Ｄ７）的次生木质部材料（图２－３）。参照Ｌｉ等在２０１４年的报道，利用ＣｈＩＰ－ｓｅｑ体逡逑系，测定了不同干旱时间点的Ｈ３Ｋ９ａｃ图谱（图２－４）邋［７５，７６］。利用ｄｉｆｉＲｅｐｓ方式鉴定了逡逑干旱５天（Ｄ５／ＮＤ）和７天（Ｄ７／ＮＤ）的Ｈ３Ｋ９ａｃ差异修饰的基因组位点。其中，干旱逡逑５天有４５７８个Ｈ３Ｋ９ａｃ修饰水平上升位点、５０８１个Ｈ３Ｋ９ａｃ修饰水平下降位点，差异富逡逑集位点共１０５５９个；干旱７天有５５３０个Ｈ３Ｋ９ａｃ修饰水平上升位点、５３９９个Ｈ３Ｋ９ａｃ逡逑修饰水平下降位点，差异修饰位点共１２０３６个（Ｐ－ａｄｊ＜０．０５）（表２－１）。己有的研究报道逡逑表明，Ｈ３Ｋ９ａｃ的修饰参与调控苔藓植物小立碗藓（／７＾５＾0？？／的／／＜３逦和拟南芥应逡逑答干旱胁迫［３９，４７］。毛果杨的ＣｈＩＰ－ｓｅｑ结果也表明，干旱胁迫后，许多基因的Ｈ３Ｋ９ａｃ修逡逑饰水平均发生了变化。所以，，Ｈ３Ｋ９ａｃ的修饰很可能也参与调控毛果杨对干旱胁迫的应逡逑答过程。逡逑－１７－逡逑
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S792.11

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本文编号：2711262