毛竹MADS-box基因家族分析及其成员参与开花调控的研究

发布时间：2020-06-16 02:56

【摘要】：我国拥有丰富的竹种资源,但是竹子遗传育种研究基础相对薄弱。部分原因是由于竹子具有特殊的开花习性,如开花周期长、时间不确定,并且大部分竹种开花后死亡,难以进行品种选育和多世代的遗传改良。刚竹属植物系中国竹亚科中,经济价值最大,种类众多的1属,毛竹(Phyllostachys edulis(Carrière)J.Houz.)是刚竹属(Phyllostachys)在中国栽培历史悠久、面积分布最广的竹种,选择毛竹这一典型的刚竹属竹种作为研究对象,研究其开花的遗传和分子调控机理,具有较高的理论研究意义和潜在的经济价值。MADS-box基因家族是植物体内的重要转录因子,它们中的很多成员广泛参与植物成花调控和花器官发育,但是在毛竹中MADS-box基因家族中各成员参与开花调控的机制尚不明确,需要开展系统研究。近年来,随着毛竹全基因组测序草图的完成,在毛竹基因组水平上对MADS-box家族成员进行功能研究具备了序列分析基础。因此本研究通过对毛竹开花相关的PeMADS进行系统的生物信息学分析和关键基因的克隆及功能研究,为探索竹子的成花机理提供基础。主要研究结果如下:利用生物信息学技术搜索和鉴定毛竹MADS-box基因,在毛竹基因组中共发现42个MADS-box基因。由于毛竹基因组序列存在较大误差,初步鉴定到的大量毛竹MADS-box基因中存在缺少关键保守结构域和序列错误的情况。首先利用转录本数据对毛竹MADS-box基因序列进行补齐和矫正,最终获得序列较为完整准确的PeMADS基因家族各成员序列。通过系统进化和基因结构分析对毛竹MADS-box基因进行了分类,并结合其与水稻、拟南芥等模式植物的同源基因进行了系统进化分析。研究发现毛竹II型MADS-box基因的数目及分组与模式植物具有高度相似性,但I型MADS-box可能在毛竹基因组进化过程中经历了大量的丢失事件,推测毛竹I型基因的进化模式不同于其他物种及II型基因,具有更高的出生率-死亡率。通过对毛竹花序不同发育时期和不开花毛竹竹叶MADS-box基因家族成员的表达分析发现,大量MADS-box基因参与到花序发育过程中,并与水稻同源基因具有相似的表达模式,这说明毛竹MADS-box基因在开花过程中起到关键作用,该分析同时对下一步开花相关的MADS-box基因家族成员的克隆和功能分析提供了重要的候选基因。从毛竹中克隆到24个MADS-box全长基因,序列比对分析表明这24个基因分别属于不同的亚组,其中SQUA-,AG-和SVP-like亚组的PeMADS基因成员最多。通过对毛竹开花过程中基因表达分析和查阅文献资料,选取9个PeMADS基因在拟南芥中异源超表达,其中4个转基因株系具有较为明显的表型变化:PeMADS3,5,19和29的转基因拟南芥提早开花;PeMADS3和PeMADS5转基因植株具有花器官发育异常的表型。以上结果说明这4个PeMADS基因可能在竹子开花中所起重要的作用,为下一步的研究打下了基础。PeMADS3和PeMADS5参与成花过程信号调控网络的功能初探。首先,对35S::PeMADS5转基因拟南芥进行RT-qPCR检测开花相关基因的表达研究表明,转基因拟南芥的莲座叶和花序中,AGL24和SOC1表达量显著高于野生型拟南芥,AP1表达量下调。推测PeMADS5通过间接调控拟南芥开花相关基因的表达情况来影响拟南芥开花时间及花器官发育。35S::PeMADS5过表达svp-31突变体(早花)的表型分析中,过表达植株和突变体开花时间没有显著变化,同时发现转基因植株花器官发育产生具有叶片状宿存的萼片,这说明PeMADS5还能调控花器官发育。除双子叶模式植物拟南芥外,还对PeMADS5进行过表达转化水稻试验,共获得10个转基因株系,对其表型进行持续观察记录。35S::PeMADS3转基因拟南芥进行RT-qPCR表达分析,结果表明PeMADS3的过表达通过调控AP1,FUL和LFY基因的表达来影响花器官的发育。35S::PeMADS3过表达ap-1突变体,转基因突变体花序变密,出现异位花器官。对PeMADS3进行过表达转化水稻试验,共获得12个转基因株系,对其表型进行持续观察记录。利用STRING软件对毛竹MADS-box家族的蛋白互作网络进行预测,共鉴定到33个互作关系,包括34个PeMADS蛋白。为进一步研究毛竹MADS-box家族成员之间的互作,分别构建25个PeMADS的酵母双杂交bait和prey载体,通过自激活检测等方法验证所构建的酵母表达载体无自激活性后,两两组合进行筛选,共有67组PeMADS蛋白之间具有相互作用。利用Cytoscape软件将酵母双杂交统验证的蛋白互作结果构建了毛竹MADS-box基因家族互作网络,为进一步了解毛竹PeMADS基因功能提供了指导。
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S795.7
【图文】：

植物,结构特征,蛋白,拟南芥

[36]。如图 1.1，植物 I 型 MADS-box 基因通常只含有守的 SRF-like MADS 域，没有 K 域，在拟南芥中，质：Mα、Mβ 和 Mγ 型[37]。 MIKC 这一命名源于结构域：MADS 域（MADS-box）、I 区（Intervening端（C terminal）[38]。植物 MIKC 型蛋白又分为 M于 K 域和 I 区的长度，MIKCc型蛋白的 I 区通常较短C*型蛋白具有 4-5 个外显子编码的较长的 I 区， M型蛋白短[35, 39]。根据 Becker 等对被子植物中主要 M果可将其分为 12 个亚家族，分别为：AG、AGL2/SEPL17、FLC、GGM13、STMADS11、AP1/SQUA、A分为 P 类和 S 类，目前，拟南芥中鉴定到的 P 类 MIKGL94，S 类蛋白有 AGL66、AGL67 和 AGL104[40]。M究最为透彻的 MADS-box 类型，相比之下，I 型 MA鲜少报道，少数研究证明其在植物雌雄配子体的发育

拟南芥,生命周期,基因

1 文献综述因家族[54]。除了提供花的同源功能外，MADS-box 基因在调控开花植物生殖发育因网络中还有许多其他功能[54, 55]。一些 MADS-box 是开花时间基因，在植物年日照长度和春化等内部及外部环境因素的影响下，抑制或促进成花转化[56MADS-box 基因也参与了花受精后种子和果实的发育。例如，AGL8/FUL 编码了芥果实分裂区正常发育所需的蛋白质[58]；SHP1 和 SHP2 基因参与了角果形态建程中细胞分裂、扩张和分化等过程[59]。此外，MADS-box 基因家族成员在营养发程中也发挥调控作用，如在胚胎、根或叶中表达的 AGL12、AGL19 和 ANR1、AGAGL3[31]。随着裸子、蕨类和藓类植物中 MADS-box 基因的深入研究，进一步证这些基因在植物中的作用并不局限于花或果实的发育[60-62]。

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