基于PCR技术对木腐真菌的快速鉴定及纤维素酶活力分析

发布时间：2020-06-16 15:39

【摘要】：木材腐朽是指木材因木腐真菌的侵害而引起木材糟烂和解体的现象。近年来我国木材腐朽现象十分普遍,木材腐朽给林业的加工生产造成巨大的经济损失。木材与人类的关系十分密切,人类的生活和生产中离不开木材的使用,然而随着我国经济的快速发展,森林资源出现严重供不应求的现象。为了提高木材质量,降低木材腐朽造成的木材损害现象,对于木腐真菌的鉴定和研究就显得尤为必要。纤维素是一种可再生性的资源,在工业生产中需要将其降解后才具有实际应用价值,它的降解主要依赖纤维素酶的催化作用。木腐真菌所分泌的纤维素酶可以较为高效地分解纤维素,因此本文对木腐真菌纤维素酶的活力进行了测定,并寻找出最优产酶条件。这为有害病原木腐真菌向有益方向进行转化,也为提高纤维素的降解率和生物转化方面提供实验基础。本文首先从林区的活立木材上采集木腐真菌子实体,用分离筛选培养基分离纯化菌种,得到两株活力较好的菌株,并用愈创木酚的方法区分出木腐真菌的木材腐朽类型。之后提取基因组DNA,运用基于PCR的分子生物学技术扩增DNA序列,对扩增产物纯化回收,测序结果登陆Genbank数据库进行序列比对,同时设计7对特异性引物和构建系统发育树分析其亲缘关系,对两株木腐真菌进行了分子水平上的鉴定。菌种鉴定结果显示,木腐真菌Y1为红缘拟层孔菌(Fomitopsis pinicola),NCBI登录号为KM373236.1。木腐真菌Y2为木蹄层孔菌(Fomes fomentarius),NCBI登陆号为HM58410.1。同时结合传统的形态学鉴定方法,对两株木腐真菌的子实体形态特征,菌落新生区的形态、生长速度、菌落颜色、菌丝气味以及菌丝结构变化等进行观察和记录。将两种鉴定方法的结果进行比对,得出两种鉴定结果一致。但传统形态学鉴定方法,是根据鉴定者以往经验和查阅参考书籍对菌种进行观察和鉴定,对同一种培养菌落形态特征描述可能会不同,或者一旦子实体的形态结构特征发生改变,可能得到不同的鉴定结果,该鉴定方法的准确性相对较低,并且木腐真菌菌落培养周期和鉴定所需时间较长。因此对比形态学鉴定方法,运用基于现代分子生物学的方法能够更加快速和准确的对木腐真菌进行鉴定。同时将两种鉴定方法相结合,能够更加可靠的对木腐真菌进行鉴定。本文在鉴定木腐真菌的基础上,对一株褐腐真菌进行纤维素酶活力分析和产酶条件优化,发酵试验表明,在初始pH 6.0、乳糖15 g/L、KH2PO4 0.5g/L、硝酸铵15 g/L、MgSO4 0.5g/L、VB1 0.4g/L,接入菌饼2块,装液量为80mL条件下培养5d时,红缘拟层孔菌的纤维素酶活力最高,内切葡聚糖酶(CMCase)为116.94 U/mL,为进一步研究褐腐真菌降解纤维素的机制提供前期基础。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S782.33
【图文】：

子实体

者浅红色显色圈出现的菌落，可以判断其腐朽类型为木材反之，无显色圈出现的菌株腐朽类型为木材褐腐。菌形态学观察方法相机对采集的新鲜木腐真菌子实体拍照，描述并记录子实。将分离筛选备用的菌株接种于 PDA 培养基中，于 25°落长满平皿所需时间。挑取培养基上生长良好的菌落菌丝时载玻片，在高倍显微镜下观察菌落生长形态、菌落颜色体等宏观和微观特征。分析菌的分离结果多株木腐真菌子实体分离纯化，得到目的菌株 Y1 和 Y2，菌株的子实体图片。Y1 侵染红松活立木，Y2 侵染白桦活养基上显示，菌株 Y1 无显色圈出现，判断菌株 Y1 为木现，为木材白腐菌。

子实体

图 2-2 子实体 Y2菌形态学鉴定结果化的两株木腐真菌子实体进行传统形态学方法鉴定，分别外部形态进行描述，分别在 25°C 恒温箱中培养菌落直至和菌落生长状态等。果可知，木腐真菌的子实体 Y1，无柄，侧生在红松活立山丘型，子实体边缘顿圆，菌盖表面比较光滑，淡黄色胶菌株生长中度较快，3-5 周内长满覆盖平皿，菌落正反面部均匀生长，菌落边缘轻微升起呈亚毡状。具有轻微蘑菇褐色，背面培养基变轻微黄色（图 2-3 和图 2-4）。

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