油茶炭疽病菌侵染寄主的细胞及其寄主生理响应机制

发布时间：2020-07-10 20:23

【摘要】：油茶是我国所特有的重要木本油料树种,具有很高的利用价值和经济价值。近年来,我国湖南、江西、广西等主要产区油茶炭疽病发生普遍,严重影响了油茶产量和品质。目前,炭疽病菌的致病机制以及油茶对炭疽病的抗病机制尚未见报道。控制油茶炭疽病的首要任务是了解病害的发病机理,关键在于阻碍炭疽病菌的侵入。因此,研究炭疽病菌侵染寄主的细胞、生化基础生物学过程,对有效防控油茶炭疽病具有重要意义。本论文从细胞、生化水平上研究炭疽病菌与油茶的互作机制,观察了炭疽病菌侵染寄主的途径及过程,检测了炭疽病菌产生致病性相关胞外酶的种类及活性,探寻了寄主抵抗病原菌相关生理生化变化,主要研究结果如下:(1)油茶炭疽病菌侵染寄主的细胞学研究。利用显微观察法、整体透明染色法和冰冻组织切片法对炭疽病菌侵染过程进行了研究。根据炭疽病菌侵染特点,可为侵入前期、侵入阶段和侵入后扩展3个主要阶段。侵染前期,即分生孢子在叶片表面的萌发阶段,接种2 h后有孢子开始萌发,长出细而短的一个或两个芽管,接种4～6 h内,分生孢子大量萌发,产生的芽管长度各不一样,孢子萌发率在9 h时高达90%;分生孢子长出芽管后,在芽管顶端产生附着胞,附着胞在接种后9h开始形成;接种后12h,附着胞基本发育成熟,呈暗褐色,中间有两个油球。侵入阶段,附着胞成熟后并附着在寄主表皮,寻找合适的位入位点,绝大多数通过产生的侵入钉直接穿透寄主侵入到寄主细胞中,少部分附着胞通过气孔侵入寄主细胞。侵入后扩展阶段,接种后36h病原菌穿破角质层后,进入表皮细胞,逐渐扩展到栅栏组织细胞中;随后,侵染菌丝进入到海绵组织中,逐渐杀死周围的细胞,5 d后叶片最终表现出典型的炭疽病症状。(2)油茶炭疽病菌侵入过程中的关键酶作用研究。通过离体培养,不同碳源(蔗糖、果胶、麸皮、羧甲基纤维索钠CMCNa、油茶叶片)均可诱导油茶炭疽病菌产生纤维素酶、果胶酶和漆酶。活体外以CMCNa为诱导底物时,羧甲基纤维素酶(Cx酶)和漆酶活性最高,分别为73.20 U/mg、4.50U/mg;以果胶为诱导底物时,果胶酶活性最高为317.73 U/mg;油茶叶作为诱导底物时,产生的纤维素酶、果胶酶和漆酶活力均较高。不同处理的5种酶液对叶片的降解作用差异明显,CMCNa诱导产生的酶液对叶片降解程度高,整个叶片呈现黑色;麸皮诱导酶液次于CMCNa;蔗糖、果胶、油茶叶诱导产生的酶液对叶片降解程度较轻,叶片局部褐变并有水渍化症状。炭疽病菌接种油茶后,发病叶片的各部位中,病健交界处的细胞壁降解酶活性最高。植株于接种4 d后开始发病,细胞壁降解酶活性迅速增强;接种6 d后滤纸酶(FPA)、β-葡萄糖苷酶和漆酶活性达到最高,分别为4.53、7.44、1.21 U/mg;Cx酶和果胶酶则在第8 d时酶活性最高,为15.79、25.49U/mg;接种10～16d,酶活性比较稳定。(3)油茶对炭疽病菌侵染的生理响应研究。通过炭疽病菌接种油茶苗,检测了活性氧的迸发,测定了不同接种时间油茶体内PAL、POD、PPO等酶活性及酚类物质和可溶性总糖含量的变化。二氨基联苯胺(DAB)显色结果表明,病原菌侵入位点周围的寄主细胞有显著的活性氧迸发,聚集了棕褐色沉淀,而且侵染时间越长,细胞表面的棕褐色沉淀越少。炭疽病菌处理后,PAL、POD和PPO等酶的活性增加,酚类物质与可溶性总糖含量升高。接种初期,PAL和POD活性缓慢上升,然后快速上升,均在第5d到达高峰值,分别为18.47U/gmin,15.40 U/gmin,随后活性下降,第9d时的活性仍比对照组高;而PPO在接种第3 d活性最高,尔后开始下降;处理组接种初期油茶体内酚类物质含量比后期高,可溶性总糖含量持续上升,接种初期时为13%,接种后9 d增长到31%。
【学位授予单位】：中南林业科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S763.7
【图文】：

菌落,附着胞,分生孢子,芽管

ＰＤＡ平板上长出的炭疽病菌菌落呈圆形，质地均匀，边缘整齐光滑。培养逡逑初期，菌落为白色；后期从平板中央，菌落颜色向四周慢慢变化，逐渐变为灰色；逡逑菌丝长满整个培养皿之后，最后变为深灰色（图２．１）。涂断菌丝继续培养３￣５ｄ，逡逑可以看到菌落上长满橘红色的分生孢子堆。逡逑图２．１胶孢炭疸菌菌落正面和背面逡逑Ｆｉｇ邋２．１邋Ｃｏｌｏｎｙ邋ｕｐｐｅｒ邋ａｎｄ邋ｒｅｖｅｒｓｅ邋ｏｆ邋Ｃ．邋ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ逡逑２．２．２炭疽病菌在油茶叶片上的萌发逡逑油茶炭疽病菌孢子在叶片上萌发的显微观察发现，采用分生孢子悬浮液接种逡逑油茶叶片，２８邋°Ｃ下２邋ｈ后有孢子开始萌发，分生孢子从一端或者两端萌发长出逡逑芽管（图２．２Ａ，邋Ａ－ｌ，Ａ－２）；接种４？６ｈ后，分生孢子大量萌发（图２．２Ｂ），产逡逑生的芽管长短不一，到９ｈ时，分生孢子萌发率高达９０％。分生孢子萌发长出芽逡逑管后，芽管顶端膨大逐渐形成附着胞。观察到的每个孢子产生一个附着胞，在萌逡逑发形成附着胞之前，分生孢子近中部产生一个隔膜（图２．２邋Ｃ，邋Ｄ）。接种１２邋ｈ后，逡逑附着胞发育成熟，椭圆形，边缘不规则，暗褐色，中间有两个油球（图２．２邋Ｅ）。逡逑１５逡逑

油茶叶片,炭疽病菌,途径,附着胞

逦■：邋■邋Ｅ逦—－逦逡逑图２．２炭疽病菌分生孢子在油茶叶片上的萌发过程逡逑Ｆｉｇ邋２．２邋Ｔｈｅ邋ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｓｐｏｒｅ邋ｏｎ邋ｌｅａｆ邋ｏｆ邋Ｃ．邋ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ逡逑Ａ、Ａ－ｌ、Ａ－２：接种２ｈ后，炭担病瞎抱子开始萌发；Ｂ、Ｃ：接种４￣６ｈ后，炭植病菌抱子逡逑大Ｍ萌发；Ｄ：接种９邋ｈ，附着胞^u始形成；Ｅ：接种１２邋ｈ，附着胞发育成熟。逡逑Ａ，Ａ－１，Ａ－２：邋Ｔｗｏ邋ｈｏｕｒｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，邋ｓｐｏｒｅ邋ｏｆ邋Ｃ．邋ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ邋ｂａｇａｎ邋ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ；邋Ｂ，Ｃ：逡逑Ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｆｏｕｒ邋ｈｏｕｒｓ邋ａｎｄ邋ｓｉｘ邋ｈｏｕｒｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，邋ｓｐｏｒｅｓ邋ｏｆ邋Ｃ．邋ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ邋ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ逡逑ｌａｒｇｅｌｙ；邋Ｄ：邋Ｎｉｎｅ邋ｈｏｕｒｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，邋ｓｐｏｒｅ邋ｏｆ邋Ｃ邋ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ邋ｃｏｍｅ邋ｉｎｔｏ邋ｂｅｉｎｇ逡逑ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ；邋Ｅ：邋Ｔｗｅｌｖｅ邋ｈｏｕｒｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，邋ｔｈｅ邋ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ邋ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ邋ｔｏ邋ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ邋．逡逑２．２．３炭疽病菌侵入油茶叶片的途径逡逑整体透明染色结果显示：在无伤接种情况下，油茶炭疽病分生孢子从一端或逡逑者两端萌发后

动态变化,纤维素酶活性

Ｆｉｇ邋２．２邋Ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｃｅｌｌｕｌａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋ｂｏｕｎｄａｒｙ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｄｉｓｅａｓｅｄ邋ａｎｄ邋ｈｅａｌｔｈｙ邋ａｒ２８逦ｒ逡逑２６逦－逦ｔ逡逑Ｉ邋．＾２０逦－逦Ｙ逡逑＾邋５逦１８逦－逡逑ｙａ邋＜逡逑g１６逡逑１４逦－逡逑１２逦－逡逑１０邋逦Ｌ逦１逦１逦１逦１逦１逦逡逑４逦６逦８逦１０逦１２逦１４逦１６逡逑接种后时间／（Ｉ逡逑Ｄａｙｓ邋ａｆｔｅｉ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ逡逑阁３．３病健处果胶酶活性的动态变化逡逑Ｆｉｇ邋２．３邋Ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｐｅｃｔｉｎａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋ｂｏｕｎｄａｒｙ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｄｉｓｅａｓｅｄ邋ａｎｄ邋ｈｅａｌｔｈｙ邋ａｒ

【参考文献】