蛋白结构完整性和松材线虫伴生细菌对Bt杀线虫活性影响研究

发布时间：2020-07-14 06:20

【摘要】：松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)是一世界性的检疫性病害,已经对我国造成了巨大的经济、生态损失,严重影响森林健康和生态安全。cry5Ba3Φ是本实验室从苏云金芽孢杆菌zjfc85上克隆得到的毒蛋白基因经密码子改造而来,其编码的毒蛋白对松材线虫毒杀活性已被证实。为进一步明确该杀虫蛋白结构与毒力功能的关系,本研究设计Cry5Ba3Φ蛋白结构突变缺陷型转灰葡萄孢菌株,并测试其毒杀活性变化。为探索长期接触Cry5Ba3Φ蛋白是否会使松材线虫产生毒力适应性表型及与线虫伴生细菌菌群间潜在的关联,本研究观察随毒蛋白接触时间和接触频次松材线虫的种群密度变化情况,并分析适应Cry5Ba3Φ蛋白前后松材线虫体内和体外的伴生细菌菌群结构。主要结果如下:1.利用生物信息学软件进行Cry5Ba3Φ毒蛋白结构域预测分析,在保留其毒性中心区的基础上破坏其完整性结构,选择了五处氨基酸位点进行截短,得到六条不同长度的cry5Ba3Φ基因片段。利用Gibson技术将这些基因片段装载到pTFCM载体上,再通过农杆菌介导的遗传转化,将cry5Ba3Φ缺失片段整合至灰葡萄孢菌的基因组中。生测实验表明,破坏Cry5Ba3Φ蛋白的不同区域结构会对其作用松材线虫的毒力造成不同程度影响。2.相比于野生型灰葡萄孢菌,用转cryBa3Φ基因灰葡萄孢菌饲喂的松材线虫其种群繁殖受到明显抑制,但是随着接触时间延长或者接触频次增加,松材线虫种群密度开始回升且与相应野生型灰葡萄孢菌上线虫的种群密度无明显差异。运用变性梯度凝胶电泳方法(DGGE)检测野生型和转cry5Ba3Φ基因灰葡萄孢菌上连续转板培养线虫的伴生细菌菌群群落结构,发现松材线虫体内和体外的伴生细菌菌群结构变化与线虫对Cry5Ba3Φ的适应能力间呈现出一定的关联性。本研究初步探索了Cry5Ba3Φ结构完整性对毒力的影响以及松材线虫伴生细菌菌群变化与线虫适应Cry5Ba3Φ毒杀活性之间的潜在关联,为下一步明确线虫伴生细菌在毒蛋白适应能力形成过程中的调控功能以及伴生细菌作用于毒蛋白的潜在方式奠定了基础。
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S763.18
【图文】：

[115]，从而达到不同DNA双链分开的分离目的(图1-1)。技术最初是被研究人员应用于医学领域，他们利用DGGE技术检测基因的突变[116]。Muyzer等首次将DGGE技术应用于微生物生态学的研究。并证4.5 PCR-RFLP 技术

Cry5Ba3Φ结构完整性与毒力关系及松材线虫伴生细菌介导的毒蛋白适应性初探endotoxin。其中，Cry5Ba3Φ的 endotoxin-N 由 7 个疏水的α螺旋形成（aa 115-161，175-177，187-211，222-256，262-290，299-315，321-326）。图 2-1 Cry5Ba3Φ功能结构Fig. 2-1 Construction of protein Cry5Ba3Φ使用 SMART 进行结构域分析，发现在 N 端（aa 202-327）和 C 端（aa 561-697）位置各含有一个 endotoxin。

23Fig. 2-4 PCR product by agarose gel electrophor（M：DNAmaker ； 1-3：pTFCM-TRP vector bacbo

【参考文献】

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本文编号：2754615