超量表达PtDET2基因对毛白杨生长发育的影响

发布时间：2020-07-16 10:06

【摘要】：杨树在生态防护上、环境美化上以及工业经济用途木材上有十分重要的作用,已成为世界上非常重要的人工林树种之一。现代分子生物技术的兴起,为林木的遗传改良提供了新的途径。杨树是根癌农杆菌的天然寄主,并易于离体繁殖以及遗传转化,已成为研究多年生的植物生长和细胞组织结构的重要模式植物。油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)在植物的生长发育过程中不仅起着重要的作用,还具有多种生理功能,如促进细胞分裂和伸长、促进细胞再分化、延缓衰老以及提高植物抗逆性等等。油菜素内酯在1982年被公认为继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸以及乙烯之后的第六大类植物激素。类固醇5α-还原酶基因(steroid 5α-reductase,DET2)属于油菜素内酯生物合成途径中的一个关键酶基因,在植物正常生长发育中起着十分重要的作用。将来源于杨树的Pt DET2基因对烟草和毛白杨进行遗传转化,取得了以下研究结果:1、植物表达载体的构建及转基因烟草的获得构建了植物表达载体,以gus::nptⅡ融合基因作为筛选标记基因和报告基因,命名为p SH-35S-Pt DET2。将构建的表达载体转化农杆菌LBA4404菌株,并采用叶盘转化法遗传转化烟草,经筛选鉴定后统计获得52株转35S::Pt DET2基因烟草。2、超量表达Pt DET2基因对烟草生长发育的影响研究发现,转35S::Pt DET2基因烟草的韧皮部细胞层数分别是野生型烟草的2.28、2.83和2.89倍,观察野生型烟草和转Pt DET2基因烟草茎的髓细胞时发现,转基因烟草的髓细胞长度大于野生型烟草。Pt DET2基因可以促进侧根、下胚轴、根毛和不定根的生长发育。分析BRs与其他激素之间的关系,结果表明:IAA与BRs在对烟草下胚轴生长上是相互独立的,在根的生长方面是相互拮抗的;IBA与BRs在烟草下胚轴生长上是相互拮抗的,在根生长方面相互独立;KT与BRs对烟草下胚轴的生长相互拮抗,对根的生长方面具有独立作用;GAs与BRs在烟草下胚轴生长方面有拮抗作用,在根生长方面存在协同作用;ABA与BRs在烟草下胚轴方面相互独立,在根生长方面相互拮抗。3、转Pt DET2基因烟草抗旱性分析选取3个不同株系TP10、TP12和TP15,在不同浓度甘露醇下模拟干旱胁迫,对种子发芽率和幼苗期进行抗旱性分析。结果发现,用300mmol/L甘露醇处理15 d,种子发芽率比野生型高40%以上,从苗期根的生长发现,野生型植株根的生长明显受到抑制;分别用20%PEG 6000处理转基因植株和野生型植株0、1、3、5和7 d,结果显示,在干旱胁迫下,转基因烟草的超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性和过氧化物酶的活性均显著高于野生型,而丙二醛的含量则显著低于野生型烟草。结果表明,超量表达Pt DET2基因可以增强烟草的抗旱性。4、转Pt DET2基因烟草抗盐性分析选取3个不同株系TP10、TP12和TP15,在不同浓度Na Cl下模拟盐胁迫,对种子的发芽率和幼苗期进行抗盐性分析,结果表明,转基因烟草种子在200mmol/L Na Cl处理下15 d后,发芽率比野生型高50%以上,而野生型烟草根的生长明显受到抑制。分别用200mmol/L Na Cl处理转基因和野生型植株0、1、3、5和7 d后,转Pt DET2基因烟草的超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性和过氧化物酶的活性均高于野生型,而丙二醛的含量则显著低于野生型烟草。结果表明,超量表达Pt DET2基因可以增强烟草的抗盐性。5、毛白杨的遗传转化用携带重组质粒的农杆菌进行目的基因的转化,经GUS组织化学染色及PCR扩增,其中3株GUS染色为阳性并扩增出目的条带,说明Pt DET2基因已经整合到了杨树的基因组中。6、超量表达Pt DET2基因对毛白杨维管束发育的影响研究发现,超量表达Pt DET2基因可以提高毛白杨木质部的厚度,增加木射线细胞与木纤维细胞层数,且细胞体积变大,数目增多。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2;S792.117
【图文】：

油菜素内酯

特别是油菜（Brassicanapus L.）的花粉提取物，能够强烈地刺激菜因此，这种花粉提取物被命名为油菜素（Brassins）。用高浓度油菜发现菜豆第二节断裂，再重新生长在一起，赤霉素（Gibberellin, 导伸长，但与此不同（Mitchell et al., 1970）。这种提取物是混合物中的“活性因子”，1974 年以来，由美国农业部启动，贝尔兹维尔农ReltsvileAgriculturalResearchCenter,BARC）、美国北区研究中心（Nal Research Center, NRRC）和东区研究中心（Eastern Regional , ERRC）参与协作公关项目（Rao et al., 2002）。1970 年，Grove 等斤的油菜花粉，最终得到了 10mg 结晶，经过 X-射线超微量分析，结构，发现属于一种甾体类物质，并命名为油菜素内酯（Brassinoli内酯的分子式为 C28H48O6（图 1.1），是一种 28 碳化合物，分子量为 274-275℃，化学名称为 2α，3α，22α，23α-4 羟-24α-甲基-β-同型--6-酮（Grove et al.,1979）。

类固醇,生物合成途径,氧化途径

4 -过程就是油菜素内酯特异合成途径（Sakurai et al., 1997）。(1) 早期 C-6 氧化途径早期 C-6 氧化途径中油菜素内酯合成的从油菜甾醇（campesterol）开始（图1.3），经过加氧、6-羟化以及氧化得到了 6-氧油菜甾烷醇（6-oxocampestanol），经羟化后得到茶甾酮（teasterone），以及脱羟基和再羟化得到香蒲甾醇（typhasterol），再经过一系列的反应最终合成油菜素内酯，此生物合成途径即为早期 C-6 氧化途径（Suzuki et al., 1995;Fujioka et al., 1995;Suzuki et al.,1994;Clouse et al., 1998）。BRs 早期 C-6 氧化途径在许多种植物中存在，比如：长春花、拟南芥、烟草等，说明早期此途径广泛存在植物中（Noguchietal.,2000）。图 1.3 油菜素类固醇的生物合成途径（Fujioka and Yokota,2003）Figure 1.3 The BR biosynthesis pathway(Fujioka and Yokota,2003)（2）晚期 C-6 氧化途径晚期 C-6 氧化途径，也被称为后期 C-6 氧化途径，是一些植物中广泛存在的另一条油菜素内酯合成途径。6-脱氧茶甾酮（6-deoxoteasterone）、6-脱氧香蒲甾醇（6-deoxotyphasterol）等 6-脱氧 BRs 以前被认为不具有生物活性或者活性很低

植物表达载体,烟草

T2 植物表达载体。gus::nptII:新霉素磷酸转移酶基因和35S:来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；Po号。 plant expression vector pSH-35S-DET2. gus::nptII: fusioferase gene and β-glucuronidase gene; 35S: plant constitucauliflower mosaic virus; PolyA: PolyA terminal sequen导的烟草遗传转化与转基因植株获得稳定后，对抗性烟草和野生型烟草的叶片进行色呈阳性的植株提取 DNA 进行 PCR 检测，野生，抗性植株中获得了目的条带。证明外源 PtDE组中，获得了 52 株转 35S::DET2 基因烟草（图

【参考文献】