国槐叶肉细胞原生质体分离研究

发布时间：2020-08-13 05:42

【摘要】：国槐(Sophora japonica L.),原产于我国北方,是一种集食用、药用、用材、城市园林绿化、观赏于一体的树种。植物原生质体是仅由原生质膜包裹的裸露的活细胞,由于没有细胞壁的阻碍,且具备细胞的全能性,个体间相互独立,均匀程度较高的特点,所以被广泛用在基础生命科学与作物育种改良中。目前尚未有国槐原生质体分离方面的研究报道,本研究通过对原生质体分离流程及叶片最佳分离时期、酶液组合浓度的优化和分离条件的确定,建立起国槐叶肉细胞原生质体分离体系,为国槐后续深入进行基因学及其他分子生物学研究提供依据。主要研究结果如下:1.原生质体分离流程及叶片最佳分离时期的确定通过参考不同植物叶肉原生质体分离方法,本研究以国槐叶片为材料进行原生质体分离,根据分离效果对分离流程加以改良,最终确定了适宜国槐叶肉原生质体分离的配制酶液、原生质体分离与纯化和原生质体计数与活力测定的方法。在温室播种培育国槐幼苗,选取不同叶龄叶片进行分离试验,其结果表明:10~15d的叶片分离得到的原生质体产量与活力均较高,且这些叶龄之间的分离效果没有显著差别;叶龄大于15d,国槐原生质体产量显著下降,并且出现细胞壁无法降解的带壁单个细胞,因此10~15d叶龄国槐实生苗叶片为最佳分离时期。2.酶液组合浓度的优化在2018年9月、2019年3月和4月三个时期在温室播种培育国槐幼苗进行分离试验。以纤维素酶R-10(1.0%、1.5%、2.0%和2.5%)、果胶酶Y-23(0.2%、0.3%、0.4%和0.5%)和离析酶R-10(0.8%、1.0%、1.2%和1.4%)为基础,进行正交试验L_(16)(4~5)。最终确定优化后的酶液组合浓度为:2018年9月,2.0%纤维素酶R-10+0.5%果胶酶Y-23+1.0%离析酶R-10;2019年3月,1.5%纤维素酶R-10+0.3%果胶酶Y-23+0.8%离析酶R-10;2019年4月,1.5%纤维素酶R-10+0.4%果胶酶Y-23+1.4%离析酶R-10。3.原生质体分离条件的遴选通过对酶液渗透压、酶解时间、酶解温度、酶液酸碱度和材料预处理进行单因素实验,最终确定不同试验时期国槐叶肉原生质体分离条件及其对应结果为:2018年9月,在含有0.5M甘露醇的CPW洗液中质壁分离1小时后,置于2.0%纤维素酶R-10+0.5%果胶酶Y-23+1.0%离析酶R-10,0.4mol/L甘露醇,pH为5.7的酶液中,在26℃条件下酶解2.5h,其原生质体产量与活力分别为8.02×10~6gFW~(-1)和84.1%。2019年3月,在含有0.5M甘露醇的CPW洗液中质壁分离1小时后,置于1.5%纤维素酶R-10+0.3%果胶酶Y-23+0.8%离析酶R-10,0.4mol/L甘露醇,pH为5.7的酶液中,在26℃条件下酶解3h,其原生质体产量与活力分别为8.48×10~6gFW~(-1)和84.4%。2019年4月,在0.5M甘露醇渗透压质壁分离处理1h后,置于1.5%纤维素酶R-10+0.4%果胶酶Y-23+1.4%离析酶R-10,0.4mol/L甘露醇,pH为5.7的酶液中,在26℃条件下酶解3h,其原生质体产量与活力分别为8.37×10~6gFW~(-1)和83.1%。4.不同生长季国槐原生质体分离酶液组合浓度及分离条件试验结果的差异,原因是试验期间温度与光照条件的不同导致植物细胞生理状况、植物细胞壁成分不同。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S792.26

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