小黑杨PsnICE1转录因子应答低温胁迫调控机理研究

发布时间：2020-08-26 12:19

【摘要】：低温会对植物生长产生不利影响,已有研究表明,ICE1基因在低温条件下可以特异性结合CBF3启动子中的MYC顺式作用元件,进而诱导CBF3调控的一系列下游基因的表达,在植物低温胁迫应答中具有重要的功能。本研究以小黑杨(Populus simonii×Pnigra)为研究对象,克隆PsnICE1基因及其启动子序列。序列比对结果显示,小黑杨PsnICE1保守结构域序列与其他物种同类的ICE1蛋白序列有较高的一致性,小黑杨PsnICE 1蛋白与其他物种ICE1蛋白序列相比,bHLH功能域以及C端高度保守,但N端序列保守性较低。系统发育树研究发现,小黑杨PsnICE1基因与蓖麻、甜杨亲缘关系较近。克隆获得PsnICE1基因上游1247 bp启动子序列,通过PlantCARE数据库预测分析发现,该段序列中含有典型的真核生物核心启动子区域,除了包含TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还存在其它可能与逆境胁迫诱导反应相关的作用元件,如ABRE、DOFCOREZM、MYBCORE、W-box 和MYCCONSENSUSATHSE等,这些元件有些与逆境胁迫诱导相关,这表明PsnICE1基因可能与逆境胁迫相关,在小黑杨抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要功能。构建pROK2-PsnICE1-GFP载体,利用基因枪技术,将PsnICE1和GFP融合表达载体通过瞬时转化法转入洋葱表皮细胞,进行亚细胞定位研究,结果显示,PsnICE1转录因子定位在细胞核中。利用qRT-PCR研究小黑杨PsnICE1基因在低温胁迫下的表达模式,结果显示,PsnICE1基因在根、茎、叶中均有表达,其表达量从胁迫1.5到72 h之间一直呈上调趋势,且在72 h时达到峰值,表明PsnICE1基因能够被低温胁迫诱导表达。PsnICE1转录因子具有转录激活活性,转录激活区在N端第66-137氨基酸内。为了分析PsnICE1基因是否具有抗寒功能,构建了PsnICE1基因过表达载体pROK2-PsnICE1及抑制表达载体pFGC5941-PsnICE1,通过农杆菌介导法获得过表达与抑制表达小黑杨植株。分别利用组织化学染色分析了低温胁迫下转基因小黑杨的H202、02-含量及细胞膜透性,并进一步测定了抗逆相关生理指标,包括MDA、H202含量、相对电导率、脯氨酸含量等的变化情况。结果显示,过表达小黑杨的MDA、H202含量和相对电导率最低,细胞膜完整性最好,而PsnICE1抑制表达植株的MDA、H2O2和02-含量及相对电导率最高,细胞膜损伤最严重。此外,PsnICE1基因能够通过调控SOD和POD基因的表达,来提高SOD和POD的活性,从而降低ROS在低温胁迫下的积累。以上结果表明PsnICE1基因过表达能够提高转基因小黑杨的抗低温能力。利用RNA-seq技术分析了PsnICE 过表达小黑杨和对照小黑杨的基因表达谱,低温胁迫下,共获得1941个差异表达基因。其中,948个为上调表达基因,993个为下调表达基因。差异基因涉及植物激素信号转导途径、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、苯丙烷生物合成途径、苯丙氨酸代谢等途径。在这些差异基因中,包括与植物逆境胁迫相关的转录因子如WRKY、NAC、bHLH等。利用以转录因子为中心的酵母单杂交技术筛选确定PsnICE1转录因子能识别5个顺式作用元件,分别为 E-box、DRE-motif、C-box、ABRE-motif 和 Unknown1,其中Unknown1元件为未知功能的元件,确定其核心序列为:GATCA。酵母单杂交、瞬时转化和EMSA结果进一步表明PsnICE1能够与这5个顺式作用元件结合。上述结果为深入研究小黑杨PsnICE1转录因子应答低温胁迫调控的分子机理及开展小黑杨抗寒分子育种提供了理论依据。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S792.11
【图文】：

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【参考文献】

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本文编号：2805162