白桦叶脉遗传调控网络构建及BpPHD3和BpPHD4对叶片大小的影响

发布时间：2020-10-08 22:13

　　植物各级叶脉彼此联通的网络系统在叶的形态、大小、空间分布及生物量中扮演重要角色。研究已证明诸多转录因子、酶分子和激素信号转导分子参与或调控叶脉的形态建成。白桦(Betula platyphylla)为高大落叶乔木,由于其枝叶扶疏、树皮洁白,具有独特的观赏价值,被广泛应用于庭院观赏和园林绿化。叶脉的形态建成对于白桦生长发育具有重大的意义。目前,关于桦树叶脉发育的分子模型仍鲜见报道。为了挖掘调控叶脉发育的关键调节因子,本研究以欧洲白桦(B.pendula)的种内变种-裂叶桦(B.penudula 'Dalecarlica')为取材对象。在裂叶桦叶脉解剖结构观察的基础上,以顶芽(DS0)和由幼嫩至成熟的不同发育阶段主脉(DS1、DS2、DS3、DS4、DS5和DS6)为材料进行转录组测序,构建基于Bottom-upgraphic Gaussian model(GGM)模型的白桦叶脉遗传调控网络。为了验证来自叶脉遗传调控网络的差异表达基因的功能,本研究通过白桦转基因技术对2个Plant Homeodomain(BpPHD3和BpPHD4)基因进行功能分析。主要研究结果如下:(1)裂叶桦主叶脉的解剖结构观察显示:基本组织、木质部、韧皮部、形成层和机械组织是主脉的主要组成成分。随着主脉的发育成熟,主脉各组成成分的厚度逐渐增大。其中,机械组织厚度与主脉厚度由DS1至DS6发育阶段的生长变化规律一致。裂叶桦转录组数据分析发现,DS1和DS4发育阶段主脉中的差异基因数量最多。此外,叶脉遗传调控网络显示,BpPHD3和BpPHD4基因在顶芽中低表达,在主脉中随着主脉的生长发育其表达量依次升高。(2)从白桦组织克隆得到BpPHD3和BpPHD4基因。序列分析显示:BpPHD3的开放阅读框为1389bp,编码462个氨基酸,具有典型的Plant Homeodomain-Like(PHD-L)保守结构域;BpPHD4的开放阅读框为1323 bp,编码440个氨基酸,具有典型的PHD-L保守结构域。(3)采用农杆菌介导法分别获得BpPHD3过表达及抑制表达白桦株系。表型分析发现,与野生型白桦相比,过表达与抑制表达株系的苗高、叶长、叶宽、叶面积和叶体积均降低,尤其过表达株系降低程度明显。叶表皮细胞方面,过表达与抑制表达株系的叶表皮细胞变大、数量降低。在叶片厚度和内部结构上,过表达与抑制表达株系表现不同。过表达株系的叶片厚度变薄,同时内部结构如上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮的厚度均变小;而抑制表达株系的叶片变厚,内部结构除下表皮以外的厚度均增大。叶脉性状上,过表达与抑制表达株系的主脉长度、二级脉数量及脉间距均变小,而主脉与二级脉间的夹角变大。主脉直径在过表达株系中降低,而在抑制表达株系中升高。内源激素含量测定结果显示,生长素IAA(Indoleacetic Acid)含量在过表达与抑制表达株系叶片中均降低。细胞分裂素ZR(Zeatin Riboside)含量在过表达株系叶片中显著降低,而在抑制表达株系中显著升高。主脉中,IAA和ZR含量在过表达与抑制表达株系中均显著降低。二级脉中,IAA含量在过表达与抑制表达株系中显著降低。ZR含量在过表达株系二级脉中降低,而在抑制表达株系中升高。活性氧测定发现,过表达与抑制表达株系叶片内的活性氧积累均不同程度的增加,其中,过表达株系的活性氧积累最多。由叶脉发育相关基因表达特性分析可知,许多与细胞周期、转录因子和生长素信号转导有关的基因表达量在BpPHD3转基因白桦叶片中发生了明显改变。其中,与细胞周期相关的基因在过表达株系中呈下调表达,而在抑制表达株系中呈上调表达。(4)采用农杆菌介导法分别获得BpPHD4过表达及抑制表达株系。表型分析发现,与对照白桦相比,过表达株系的苗高、叶长、叶宽、叶面积、叶厚度和叶体积均降低;上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度和海绵组织厚度均减少;叶表皮细胞变小、细胞数量增加;叶片内的IAA和ZR含量均降低;叶片内的活性氧积累增加;主脉长度、二级脉的数量和主脉直径均降低;主脉和二级脉的IAA和ZR含量均降低。然而,抑制表达株系在以上性状上与超表达株系呈现相反的结果。由叶脉发育基因表达特性分析可知,许多与细胞周期、转录因子和生长素信号转导有关的基因表达量在BpPHD4转基因白桦中发生了明显改变。其中,与细胞周期相关的基因在过表达株系叶片中呈上调表达,而在抑制表达株系中下调表达。(5)BpPHD4过表达白桦转录组测序结果显示,多数与细胞壁组成、防御机制和生长素合成及信号转导相关的基因呈下调表达;与细胞数量、细胞周期、染色体结构有关的基因呈上调表达。将BpPHD4过表达白桦转录组数据与欧洲白桦基因组相结合预测BpPHD4的靶基因,28条涉及防御机制、细胞周期、植物激素及其它发育过程的基因为候选靶基因。综上所述,在白桦叶脉遗传调控网络中,BpPHD3和BpPHD4是叶片形态发生和叶脉发育过程中重要的转录因子成员。其中,BpPHD3通过调节内源激素稳态、叶脉发育基因的表达和活性氧的积累从而改变叶片大小和脉络结构特征;BpPHD4通过抑制内源激素合成、增加活性氧的积累及调控叶脉发育基因的表达从而抑制叶片和叶脉的发育。本研究从分子生物学角度分析了白桦叶脉发育的分子模型,探讨了叶脉形成与发育的分子机制。本研究结果不仅可以丰富植株叶片形态建成的基础理论,也为植物叶片的分子设计和品种改良提供参考。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S792.153
【部分图文】：

位置分布,叶原基,生长素,基因家族

计算机技术、转基因技术、基因突变、基因编辑等多种手段，一系列参与叶脉形态建成逡逑和发生的遗传调控基因已相继被识别［２２＿３（），５５＿５６］。逡逑１．３．１叶原基发育逡逑叶原基细胞的维持、分裂与分化的能力是植物形态建成起始和发生的必备条件［５５］。逡逑在遗传学水平上，叶原基的形成和发育依赖于多遗传因子与生长素通过相互协调的作用逡逑方式组成复杂而精细的基因调控网络（图１邋－１）［５６］。在此调控网络中，（ＰＨＯｉＪＭＥＤ逡逑７）基因分布于ＳＡＭ的外表皮细胞中，主要负责引导生长素从底端向分生组织的顶端逡逑运输［５６］。ＸＴＶＯＷ逦欣ｅ邋／ｚｏｗｅｏＺｗｘ邋７）基因是维持植物分生组织分化能力逡逑和起始发育的关键因子［１，５６］。在整个ＳＡＭ中，？９Ｘ７基因表达位置分布广泛，其表达逡逑受生长素的浓度水平调节。NBＳ７逦基因是已知的叶极性建立的关逡逑键因子之一［５７］，其与生长素共同抑制Ｋ９Ｘ基因家族的说５逦五ＺＺｔ／幻基逡逑因的表达活性，从而促进嫩叶组织从叶原基中不断分离。在叶原基发育过程中，负逡逑向调控幻ＶＱＴ基因家族的兄４＃７７逦欣ｅ邋２）和尤沿－／汝ｅ邋（５）的表达逡逑水平［１’坤。与此同时，／ＱＶＯＸ基因家族的再进一步抑制逡逑ＡＳ７的表达量［５６］。由此可见，众多基因与生长素及其信号分子的协同与拮抗作用从分子逡逑水平维持顶端分生组织的分裂活性并促进新的侧生器官从叶原基中不断分离［４２］。逡逑

技术路线图,技术路线,叶脉

对叶片形态发生和叶脉发育的分子功能，为木本植物叶脉及维管发育提供参考依据。逡逑１．５．２技术路线逡逑本研究的技术路线如图１－４所示。逡逑裂叶桦逡逑Ｉ￣￣＇逦逦逡逑顶芽邋１逦｜不同发育阶段逡逑＾．邋Ｔ逦———＾逦１邋■逡逑转录纟ｉ测序逦丨逦Ｉ邋形态学观察￣逡逑逦邋小逦逦逡逑Ｂｏｔｔ

调节基因,木质部,发育阶段,皮部

２．３．１裂叶桦主灥剖学观察逡逑本研宄中，我们采用解剖学观察方法追踪裂叶桦主脉由幼嫩至成熟的形态特点。结逡逑果（图２－４）表明，基本组织（ＧＴ）、木质部（Ｘ）、初皮部（Ｐｈ）、形成层（Ｃａ）和机逡逑械组织（ＭＴ）是裂叶桦主脉的重要组成成分，在不同发育阶段，这些组成成分呈现不逡逑同的形态特征。在主脉横切面上，被番红染成红色的拱形状木质部由径向规则排列的导逡逑管分子构成，拱形木质部外侧为韧皮部。ＤＳ１发育阶段的导管细胞较小、排列不规则，逡逑此发育阶段的木质部与初皮部分界不明显。ＤＳ２发育阶段导管细胞排列趋于规则，与幵逡逑皮部分界明显。ＤＳ３至ＤＳ６发育阶段方面，导管细胞排列完全规则，与幵皮部分界明逡逑显。木质部与韧皮部由形成层连接，ＤＳ１发育阶段的主脉形成层与木质部、韧皮部紧密逡逑结合，其余发育阶段的形成层能够在显微水平肉眼可见。拱形状木质部内侧为支撑叶片逡逑的机械组织

【参考文献】