杨树生长素应答因子IAA9-ARF5.1调控木材发育的分子机理研究

发布时间：2020-10-21 06:54

　　 木材是自然界最重要的可再生资源,是人类制浆造纸、建筑业以及生物能源的主要原材料。改良木材性状,优化木材资源品质已成为当前林木育种的重要目标。在木材形成过程中,植物激素特别是生长素,被认为对维管形成层起始和次生木质部分化具有关键的调节作用。已有研究证实,生长素浓度在形成层中最高,随着韧皮部及木质部分化,其含量逐渐降低。根据目前的生长素信号转导模型,Aux/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)和ARF(auxin response factor)是介导生长素响应的两个关键蛋白家族。研究表明,ARF与Aux/IAA对植物(原)形成层活动及维管系统的发育具有非常重要的作用,但其具体调控机制仍待进一步探索。杨树(Populus trichocarpa)是世界上分布最广的用材树种。随着其全基因组测序完成,杨树作为模式植物被广泛应用于树木次生发育的研究中。本研究以毛白杨为实验材料,通过对重要Aux/IAA及ARF基因的分析,揭示其对杨树次生发育的重要作用,初步弄清了生长素对木材发育的调控网络。主要研究结果如下:1.参与木材发育的杨树Aux/IAA候选基因筛选杨树基因组包含35个全长Aux/IAA编码基因,通过对已有的杨树微阵列表达数据(microarray)、转录组测序数据(RNA-seq)的分析,确定IAA9在木材发育相关组织中表达特异性较高,暗示其可能对木质部发育有调控作用。2.IAA9在维管形成层部位特异表达野生型毛白杨中,IAA9在木质部、韧皮部、茎、根中均有较高的表达量。启动子GUS染色结果表明,在维管形成层区域出现较强的GUS活性。原位杂交结果也进一步证实IAA9在维管形成层部位特异性高表达。3.IAA9是典型的Aux/IAA蛋白在野生型毛白杨中,外施生长素显著诱导IAA9表达。在烟草瞬时浸染实验中,外施生长素会减少IAA9叶片中的GFP信号,而在突变VGWPP氨基酸序列后的IAA9m中,生长素并不会对GFP信号产生显著影响。表明IAA9在转录水平上受到生长素的诱导,在蛋白水平上受到生长素的降解,且降解区域位于第二结构域。亚细胞定位实验显示,IAA9定位在细胞核中。酵母自激活实验证实IAA9是转录抑制子。因此IAA9具备了Aux/IAA蛋白的典型分子特征。4.IAA9过表达抑制杨树次生木质部形成构建IAA9过表达载体转入毛白杨,发现与野生型相比,转基因杨树的株高、茎直径等都明显下降。茎横切片甲苯胺蓝染色结果显示,过表达植株的次生木质部发育受到明显抑制,木质部细胞层数减少,相对面积下降。荧光定量PCR检测表明,转基因杨树中木质素合成关键酶基因表达量均有不同程度的下调。5.IAA9和ARF5能够发生蛋白相互作用酵母双杂交实验证实,IAA9和ARF5.1,ARF5.2能在体外发生相互作用。通过双分子荧光互补实验,确定IAA9和ARF5.1在体内也存在蛋白相互作用。6.ARF5.1能够恢复IAA9过表达植株次生发育表型将全长和去掉Ⅲ、Ⅳ结构域的ARF5.1过表达载体转入IAA9m-OE转基因植株中发现,全长ARF5.1对IAA9m-OE的回复在株高、木质部发育等方面,可接近野生型水平,ARF5.1Δ/IAA9m-OE中会完全恢复IAA9m-OE表型。酵母自激活和酵母双杂实验表明,ARF5.1Δ依然具有激活活性,但却不能和IAA9发生相互作用。7.IAA9-ARF5复合体调控HB基因表达荧光定量PCR结果显示,在IAA9m-OE转基因株系中,HB7和HB8基因表达量明显下调。用生长素分别处理野生型和IAA9m-OE转基因植株发现,这两个基因的转录水平都受到生长素的诱导,且在生长素信号被阻断的IAA9m-OE转基因植株中,生长素对其的诱导明显消失。这说明HB7和HB8基因可能参与生长素介导的木质部发育调控网络。ChIP实验结果证明,ARF5.1可直接结合HB7和HB8上游启动子序列,从而调控其基因表达。综上所述,IAA9在杨树木材发育相关组织中表达量高,并参与茎次生木质部的发育。IAA9通过和ARF5.1相互作用形成蛋白复合体,通过ARF5.1上的DNA结合区域结合下游基因HB7和HB8,并调控其表达,影响形成层向木质部细胞的分化,进而调控木材发育。这些结果将为解释生长素信号调控木材发育提供理论依据,为木材资源的优化奠定分子基础。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2;S792.11
【部分图文】：

西南大学硕士学位论文官的胚胎发生过程中也有相类似的过程。如在拟南芥种子萌发后不久，原组织以一种器官特有的方式被定义成为木质部或韧皮部，并在原形成层组化，随后未分化的细胞会产生维管形成层[12]。因此，拟南芥的形成层活动原维管束的束内形成层，随后延伸到束间区域，形成一个闭合的分生细胞维管形成层[13, 14]。

第 1 章 文献综述在一些老茎中，这些分生细胞实际上是从次生韧皮部招募而来的。在的两侧，可以径向定义为参与细胞分裂、细胞扩展和细胞分化的 3 个的次生发育可以分为两个阶段：较早的阶段只产生维管和薄壁细胞，段形成层开始产生维管和木质化的纤维细胞。与次生韧皮部相比，拟相对较多的次生木质部[20, 21]。

图 1.3 杨树及拟南芥次生壁合成的转录调控网络[23]Fig. 1.3 Transcriptional regulatory network controlling secondary cell wall biosynthesiArabidopsis and Populus2.4 形成层的转录调控网络形成层的分裂分化活动会影响木质部和韧皮部的形成，因此关于形成活动也是当前研究的重点。近年来，利用分子生物学手段已经证实，许与调控维管形成层的活性。如 WOX4，参与调控维管茎细胞的分裂，可
【参考文献】

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本文编号：2849793