84K杨PagC3H3基因克隆及功能分析
发布时间：2020-10-29 16:24
木质素作为木材的主要组成成分,通常是由三种单体聚合而成,在其生物合成过程中,共有10个酶家族参与负责将苯丙胺酸转化为单体木质素,其中C3H是在对-香豆酰酿辅酶A(p-coumaroyl CoA)到咖啡酰辅酶A(caffeoyl CoA)的经基化过程和G/S单体形成中的关键控制酶类,探究PagC3H究基因的功能,对于林木选育和材性改良具有重要意义。本文主要通过从84K杨中克隆获得了PagC33基因,并进行了基因组织特异性表达分析和启动子功能探究,从而对基因的表达模式进行了验证,通过过量表达和RNAi抑制表达并遗传转化84K杨对PagC3H3基因进行了生物学功能的初步探究,结果如下:(1)84K杨PagC3H3基因CDS全长为1527 bp,编码一个由508个氨基酸残基组成的蛋白质序列;组织特异性表达分析显示,该基因在84K杨不同组织中表达存在差异,在根、中部茎节和基部茎节等木质化程度高的组织中表达量较高,在其他部位表达量较低;克隆得到了 2035 bp长的PagC3H3启动子序列,瞬时转化拟南芥和遗传转化84K杨,GUS染色结果均显示在木质化程度高的部位着色较深,推测84K杨PaagC3H3启动子调控PagC3HP基因在木质化程度高的组织中强烈表达。(2)对PagC3H3蛋白的亚细胞定位进行了验证,结果显示:PagC3H3-GFP的绿色荧光信号仅在细胞质中显示,由此推测PagC3H3是一个定位于细胞质中的功能蛋白。(3)过表达株系(OE-PagC3H3)具有明显的生长优势,株高明显高于野生型,而RNAi抑制表达株系(RNAi-PagC3H3)生长缓慢,株高低于野生型;过表达株系叶片比同一位置野生型的叶片大,RNAi抑制表达株系则比野生型叶片小,且同一株系第七片叶片均比第六片叶片大。(4)过表达株系木质部层数都要比野生型多,而RNAi抑制表达株系木质部层数则要比野生型少;同一植株由上而下的第八、第九、第十茎段木质部层数都逐渐增加。(5)对不同转基因株系进行木质部木质素、纤维素、半纤维素三种成分含量的测定发现,PagC3H3基因过表达显著提高了木质素含量,抑制表达显著降低了木质素含量,而纤维素和半纤维素的含量变化差异不显著,推测PagC3H3基因在木质素合成中发挥作用。(6)对转基因株系进行抗虫性试验发现,舞毒蛾3龄幼虫在取食时倾向选择木质素含量较少,木质化程度较低的抑制表达株系叶片,而对过表达株系叶片取食较少,进一步证实了PagC3H3基因在植物体内调控木质素的合成中发挥了重要作用。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S792.11
【部分图文】：
?７０??Ｐｏｓｉｔｉｏｎ??图２－４?８４Ｋ杨ＰａｇＣ３Ｈ３蛋白的信号肽预测??Ｆｉｇ．?２＞４?Ｓｉｇｎａｌ?ｐｅｐｔｉｄｅ?ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＰａｇＣ３Ｈ３?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ?Ｐｏｐｕｌｕｓ?ａｌｂａ?ｘ?Ｐ．?ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ??２．３．２＿３?８４Ｋ杨ＰａｇＣ３Ｈ３蛋白保守结构域分析??利用?ＮＣＢＩ?中的在线工具?Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?Ｄｏｍａｉｎ?Ｓｅａｒｃｈ?Ｓｅｒｖｉｃｅ?（ＣＤ?Ｓｅａｒｃｈ）对??ＰａｇＣ３Ｈ３蛋白的保守结构域进行预测，结果显示在第１？５０２个氨基酸区间内包含有??ｐ４５０?ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ结构域
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将两周龄的拟南芥幼苗浸泡在农杆菌（ｐＢＩＵｌ－ＰａｇＣＪ／＾ｐｒｏ．ｖＧｔ／Ｓ）菌液中，进行??瞬时转化，之后将共培养的拟南芥经ＧＵＳ染色，固定脱色处理后，在实体显微镜下观??察ＧＵＳ染色情况，结果显示，在拟南芥下胚轴和根中着色较深（图３－５），推测８４Ｋ??杨ＰＭＣ５／／Ｊ启动子调控下游基因在木质化程度高的组织中表达。??ｍ??图３－５尸ａｇＣ３出启动子驱动ＧＵＳ在拟南芥中的ＧＵＳ染色??Ｆｉｇ．?３－５?ＧＵＳ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｄｒｉｖｅｎ?ｂｙ?ｔｈｅ?ＰａｇＣ３Ｈ３?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｍ?Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ??３．３．４?ｐＢｎ２１－／＾Ｃｍ？ｐｒｏ：：Ｇ仍载体遗传转化?８４Ｋ?杨??将农杆菌（ｐＢＩ１２１－ＰｏｇＣＪ／／＿５ｐｒｏ．＿：ＧａＳ）摇菌活化，利用叶盘法对８４Ｋ杨进行遗传??转化，将共培养２ｄ后的叶片放入含有１０?ｍｇ／Ｌ?Ｋａｎ的选择培养基上进行抗性筛选，大??约２０?ｄ后，叶片愈伤处分化出不定芽，切取不定芽放入含有４０?ｍｇ／Ｌ?Ｋａｎ的选择培养基??中继续进行筛选（图３－６Ａ）
【参考文献】
本文编号：2861155
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S792.11
【部分图文】：
?７０??Ｐｏｓｉｔｉｏｎ??图２－４?８４Ｋ杨ＰａｇＣ３Ｈ３蛋白的信号肽预测??Ｆｉｇ．?２＞４?Ｓｉｇｎａｌ?ｐｅｐｔｉｄｅ?ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＰａｇＣ３Ｈ３?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ?Ｐｏｐｕｌｕｓ?ａｌｂａ?ｘ?Ｐ．?ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ??２．３．２＿３?８４Ｋ杨ＰａｇＣ３Ｈ３蛋白保守结构域分析??利用?ＮＣＢＩ?中的在线工具?Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?Ｄｏｍａｉｎ?Ｓｅａｒｃｈ?Ｓｅｒｖｉｃｅ?（ＣＤ?Ｓｅａｒｃｈ）对??ＰａｇＣ３Ｈ３蛋白的保守结构域进行预测，结果显示在第１？５０２个氨基酸区间内包含有??ｐ４５０?ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ结构域
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将两周龄的拟南芥幼苗浸泡在农杆菌（ｐＢＩＵｌ－ＰａｇＣＪ／＾ｐｒｏ．ｖＧｔ／Ｓ）菌液中，进行??瞬时转化，之后将共培养的拟南芥经ＧＵＳ染色，固定脱色处理后，在实体显微镜下观??察ＧＵＳ染色情况，结果显示，在拟南芥下胚轴和根中着色较深（图３－５），推测８４Ｋ??杨ＰＭＣ５／／Ｊ启动子调控下游基因在木质化程度高的组织中表达。??ｍ??图３－５尸ａｇＣ３出启动子驱动ＧＵＳ在拟南芥中的ＧＵＳ染色??Ｆｉｇ．?３－５?ＧＵＳ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｄｒｉｖｅｎ?ｂｙ?ｔｈｅ?ＰａｇＣ３Ｈ３?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｍ?Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ??３．３．４?ｐＢｎ２１－／＾Ｃｍ？ｐｒｏ：：Ｇ仍载体遗传转化?８４Ｋ?杨??将农杆菌（ｐＢＩ１２１－ＰｏｇＣＪ／／＿５ｐｒｏ．＿：ＧａＳ）摇菌活化，利用叶盘法对８４Ｋ杨进行遗传??转化，将共培养２ｄ后的叶片放入含有１０?ｍｇ／Ｌ?Ｋａｎ的选择培养基上进行抗性筛选，大??约２０?ｄ后，叶片愈伤处分化出不定芽，切取不定芽放入含有４０?ｍｇ／Ｌ?Ｋａｎ的选择培养基??中继续进行筛选（图３－６Ａ）
【参考文献】
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3 周熙莹;84K杨再生和遗传转化体系的研究[D];东北林业大学;2013年
本文编号：2861155
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