白桦早衰突变体的鉴定与研究
发布时间：2020-12-15 19:02
衰老是植物生长发育的重要生命过程,通过衰老的发生,植物可以自我保护和抵抗不良外界环境。衰老的调控机制非常复杂,而早衰突变体的发现为人们研究衰老的机制提供了理想的工具。本实验室在研究白桦（Betula platyphylla×B.pendula）BpGH3.5基因时,获得了 21个超表达株系,其中有一个株系叶片表面逐渐长有褐色的斑点,叶片提前脱落,表现为早衰的表型,命名为lmd（Lesion mimic and defoliation）株系。选取突变株系lmd、转基因对照G21株系、野生型对照WT株系进行了植株生长、光合生理、细胞结构、组织化学染色、相关酶类活性变化、抗病性等方面的研究。实验结果表明,lmd株系的株高、地径和净光合速率均显著低于两个对照株系,而其他的光合指标和叶绿素荧光参数与两个对照株系相比并无显著差别。实体显微镜观察发现lmd株系第4叶开始,叶片表面出现褐色斑点,并且斑点的数目随着叶龄的增加而逐渐增加,但其大小并未发生改变。石蜡切片结果表明褐色斑点处的细胞已经死亡,Evans blue染色结果表明lmd株系叶片死亡细胞数目显著多于两个对照。细胞超微结构观察发现lmd株系...
【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 影响植物叶片衰老的因素
1.1.1 叶片衰老的外部因素
1.1.2 叶片衰老的内部因素
1.2 植物衰老的生理生化变化
1.3 植物衰老的分子机理
1.3.1 叶片衰老的多水平调控
1.3.2 植物衰老相关基因
1.4 EIN3/EILs转录因子家族研究进展
1.4.1 EIN3/EILs参与乙烯信号转导
1.4.2 EIN3/EILs与植物的抗逆性有关
1.4.3 EIN3/EILs调节乙烯与其它激素的交叉对话
1.5 本研究的目的与意义
2 白桦早衰突变体的特征
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 供试菌种
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 株高和地径的调查
2.2.2 光合速率和叶绿素荧光参数的测定
2.2.3 叶片表面超微结构的观察
2.2.4 石蜡切片的制备与观察
2.2.5 叶片超微结构的观察
2.2.6 组织化学染色
2.2.7 POD、SOD及MDA的测定
2.2.8 抗病性观察
2.3 实验结果
2.3.1 lmd、G21、WT株系生长性状比较
2.3.2 lmd、G21、WT株系光合特性和叶绿素荧光参数比较
2.3.3 lwd、G21、WT株系叶片表面超微结构观察
2.3.4 lmd、G21、WT株系叶片组织解剖结构的观察
2.3.5 lmd、G21、WT株系叶片超微结构观察
2.3.6 组织化学染色
2.3.7 POD、SOD、MDA测定
2.3.8 lmd、G21、WT株系抗病性分析
2.4 本章小结
3 白桦早衰形成相关基因表达的分析
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.2.1 RNA的提取与反转录
3.2.2 RNA文库的构建及测序
3.2.3 转录组文库质量评估
3.2.4 基因表达量及差异基因分析
3.2.5 qRT-PCT方法验证表达谱测序结果
3.2.6 内源激素含量的测定
3.3 实验结果
3.3.1 RNA的获得
3.3.2 测序数据统计与评估
3.3.3 转录组测序文库质量评估
3.3.4 差异表达基因数目统计
3.3.5 lmd、G21和WT 3个株系功能叶片差异基因分析
3.3.6 基因共表达分析
3.3.7 qRT-PCR验证
3.3.8 lmd突变株早衰分子机制分析
3.4 本章小结
4 T-DNA插入位点侧翼序列分析
4.1 实验材料
4.2 实验方法
4.2.1 白桦总DNA的提取
4.2.2 Southern杂交
4.2.3 早衰突变体lmd基因组重测序
4.2.4 TAIL-PCR
4.2.5 插入位点的验证
4.3 实验结果
4.3.1 白桦总DNA的获得
4.3.2 T-DNA插入位点数的确定
4.3.3 lmd突变株基因组重测序分析
4.3.4 T-DNA插入位点的侧翼序列的获得
4.3.5 插入位点的验证
4.4 本章小结
5 白桦BpEIN3基因功能初步研究
5.1 实验材料
5.1.1 植物材料
5.1.2 载体与菌株
5.2 实验方法
5.2.1 BpEIN3启动子的生物信息学分析
5.2.2 BpEIN3启动子的克隆及表达载体构建
5.2.3 BpEIN3基因克隆及过表达载体构建
5.2.4 BpEIN3基因抑制表达载体构建
5.2.5 工程菌的制备及遗传转化
5.2.6 转基因植株的PCR检测及基因定量分析
5.2.7 BpEIN3启动子的活性分析
5.2.8 转基因植株的表型观察
5.3 结果与分析
5.3.1 BpEIN3启动子序列顺式作用元件分析
5.3.2 BpEIN3启动子的克隆及表达载体构建
5.3.3 BpEIN3基因的克隆及表达载体构建
5.3.4 BpEIN3基因抑制表达载体构建
5.3.5 转基因植株的PCR及qRT-PCR检测
5.3.6 BpEIN3启动子的活性分析
5.3.7 转基因植株的表型观察
5.4 本章小结
6 讨论与结论
6.1 讨论
6.1.1 植物叶片衰老与细胞程序性死亡
6.1.2 植物叶片早衰与抗病性的关系
6.1.3 植物叶片衰老与基因表达
6.1.4 植物EIN3基因在衰老和类病斑形成中的调控机制
6.2 结论
6.3 展望
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
附件
【参考文献】：
期刊论文
[1]赤霉素GA4+7处理下白桦无性系生长及差异基因表达分析[J]. 刘宇,徐焕文,刘桂丰,姜静. 林业科学研究. 2017(01)
[2]烟粉虱病原真菌的分离鉴定及生物活性初步研究[J]. 王铁军,钟万芳,朱丽梅,王耘,陈冬,康秋玉,赵明珠. 江苏农业科学. 2016(11)
[3]水稻生育后期外源赤霉素调控稻草饲用品质的机理研究[J]. 董臣飞,顾洪如,丁成龙,许能祥,张文洁. 草业学报. 2016(11)
[4]作物诱变育种研究进展[J]. 杨震,彭选明,彭伟正. 激光生物学报. 2016(04)
[5]基于RNA-Seq技术的谷子新基因发掘及基因结构优化[J]. 穆彩琴,张瑞娟,屈聪玲,韩渊怀,王兴春,杨致荣. 植物生理学报. 2016(07)
[6]苹果果实可溶性固形物含量相关基因的全基因组筛选与分析[J]. 苑克俊,程来亮,牛庆霖,王江勇. 植物生理学报. 2016(05)
[7]木薯EIN3基因的序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯诱导表达特性[J]. 丛汉卿,齐尧尧,张振文,陈松笔,乔飞. 分子植物育种. 2015(12)
[8]基于转录组高通量测序分析白光对杜仲愈伤组织中绿原酸含量的影响[J]. 张俊娥,邓华锋,郑文强,江京,金聪,赵夫凯. 江西师范大学学报(自然科学版). 2015(06)
[9]植物激素乙烯作用机制的最新进展[J]. 李文阳,马梦迪,郭红卫. 中国科学:生命科学. 2013(10)
[10]染色体步移技术克隆已知序列侧翼启动子的研究进展[J]. 康丹,方小艳,游腾飞,王婷婷,眭安平,杨星勇. 农业生物技术学报. 2013(03)
博士论文
[1]水稻tree1增变表型的分子遗传学研究[D]. 胡兴明.中国农业科学院 2017
[2]铝胁迫下杉木无性系苗若干生理过程及转录组的研究[D]. 马志慧.福建农林大学 2015
[3]白桦BpMYB106转录因子的功能研究[D]. 周晨光.东北林业大学 2014
[4]白桦BplMYB46基因调控抗旱耐盐和次生壁形成的分子机理[D]. 国会艳.东北林业大学 2014
硕士论文
[1]转录组分析文冠果幼苗抗冷性机制[D]. 王伟.山东农业大学 2015
[2]离体加倍创造欧李多倍体种质及其鉴定[D]. 史文秀.山西农业大学 2015
[3]基于RNA-seq技术对西瓜果皮色泽差异表达基因的分析[D]. 杨侃侃.江西农业大学 2015
[4]基于重测序技术的美洲黑杨×小叶杨亲本变异位点检测分析[D]. 徐后喜.南京林业大学 2015
[5]莱茵衣藻富硒生物学特性及其转录组学研究[D]. 程雪薇.深圳大学 2015
本文编号：2918756
【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 影响植物叶片衰老的因素
1.1.1 叶片衰老的外部因素
1.1.2 叶片衰老的内部因素
1.2 植物衰老的生理生化变化
1.3 植物衰老的分子机理
1.3.1 叶片衰老的多水平调控
1.3.2 植物衰老相关基因
1.4 EIN3/EILs转录因子家族研究进展
1.4.1 EIN3/EILs参与乙烯信号转导
1.4.2 EIN3/EILs与植物的抗逆性有关
1.4.3 EIN3/EILs调节乙烯与其它激素的交叉对话
1.5 本研究的目的与意义
2 白桦早衰突变体的特征
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 供试菌种
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 株高和地径的调查
2.2.2 光合速率和叶绿素荧光参数的测定
2.2.3 叶片表面超微结构的观察
2.2.4 石蜡切片的制备与观察
2.2.5 叶片超微结构的观察
2.2.6 组织化学染色
2.2.7 POD、SOD及MDA的测定
2.2.8 抗病性观察
2.3 实验结果
2.3.1 lmd、G21、WT株系生长性状比较
2.3.2 lmd、G21、WT株系光合特性和叶绿素荧光参数比较
2.3.3 lwd、G21、WT株系叶片表面超微结构观察
2.3.4 lmd、G21、WT株系叶片组织解剖结构的观察
2.3.5 lmd、G21、WT株系叶片超微结构观察
2.3.6 组织化学染色
2.3.7 POD、SOD、MDA测定
2.3.8 lmd、G21、WT株系抗病性分析
2.4 本章小结
3 白桦早衰形成相关基因表达的分析
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.2.1 RNA的提取与反转录
3.2.2 RNA文库的构建及测序
3.2.3 转录组文库质量评估
3.2.4 基因表达量及差异基因分析
3.2.5 qRT-PCT方法验证表达谱测序结果
3.2.6 内源激素含量的测定
3.3 实验结果
3.3.1 RNA的获得
3.3.2 测序数据统计与评估
3.3.3 转录组测序文库质量评估
3.3.4 差异表达基因数目统计
3.3.5 lmd、G21和WT 3个株系功能叶片差异基因分析
3.3.6 基因共表达分析
3.3.7 qRT-PCR验证
3.3.8 lmd突变株早衰分子机制分析
3.4 本章小结
4 T-DNA插入位点侧翼序列分析
4.1 实验材料
4.2 实验方法
4.2.1 白桦总DNA的提取
4.2.2 Southern杂交
4.2.3 早衰突变体lmd基因组重测序
4.2.4 TAIL-PCR
4.2.5 插入位点的验证
4.3 实验结果
4.3.1 白桦总DNA的获得
4.3.2 T-DNA插入位点数的确定
4.3.3 lmd突变株基因组重测序分析
4.3.4 T-DNA插入位点的侧翼序列的获得
4.3.5 插入位点的验证
4.4 本章小结
5 白桦BpEIN3基因功能初步研究
5.1 实验材料
5.1.1 植物材料
5.1.2 载体与菌株
5.2 实验方法
5.2.1 BpEIN3启动子的生物信息学分析
5.2.2 BpEIN3启动子的克隆及表达载体构建
5.2.3 BpEIN3基因克隆及过表达载体构建
5.2.4 BpEIN3基因抑制表达载体构建
5.2.5 工程菌的制备及遗传转化
5.2.6 转基因植株的PCR检测及基因定量分析
5.2.7 BpEIN3启动子的活性分析
5.2.8 转基因植株的表型观察
5.3 结果与分析
5.3.1 BpEIN3启动子序列顺式作用元件分析
5.3.2 BpEIN3启动子的克隆及表达载体构建
5.3.3 BpEIN3基因的克隆及表达载体构建
5.3.4 BpEIN3基因抑制表达载体构建
5.3.5 转基因植株的PCR及qRT-PCR检测
5.3.6 BpEIN3启动子的活性分析
5.3.7 转基因植株的表型观察
5.4 本章小结
6 讨论与结论
6.1 讨论
6.1.1 植物叶片衰老与细胞程序性死亡
6.1.2 植物叶片早衰与抗病性的关系
6.1.3 植物叶片衰老与基因表达
6.1.4 植物EIN3基因在衰老和类病斑形成中的调控机制
6.2 结论
6.3 展望
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
附件
【参考文献】：
期刊论文
[1]赤霉素GA4+7处理下白桦无性系生长及差异基因表达分析[J]. 刘宇,徐焕文,刘桂丰,姜静. 林业科学研究. 2017(01)
[2]烟粉虱病原真菌的分离鉴定及生物活性初步研究[J]. 王铁军,钟万芳,朱丽梅,王耘,陈冬,康秋玉,赵明珠. 江苏农业科学. 2016(11)
[3]水稻生育后期外源赤霉素调控稻草饲用品质的机理研究[J]. 董臣飞,顾洪如,丁成龙,许能祥,张文洁. 草业学报. 2016(11)
[4]作物诱变育种研究进展[J]. 杨震,彭选明,彭伟正. 激光生物学报. 2016(04)
[5]基于RNA-Seq技术的谷子新基因发掘及基因结构优化[J]. 穆彩琴,张瑞娟,屈聪玲,韩渊怀,王兴春,杨致荣. 植物生理学报. 2016(07)
[6]苹果果实可溶性固形物含量相关基因的全基因组筛选与分析[J]. 苑克俊,程来亮,牛庆霖,王江勇. 植物生理学报. 2016(05)
[7]木薯EIN3基因的序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯诱导表达特性[J]. 丛汉卿,齐尧尧,张振文,陈松笔,乔飞. 分子植物育种. 2015(12)
[8]基于转录组高通量测序分析白光对杜仲愈伤组织中绿原酸含量的影响[J]. 张俊娥,邓华锋,郑文强,江京,金聪,赵夫凯. 江西师范大学学报(自然科学版). 2015(06)
[9]植物激素乙烯作用机制的最新进展[J]. 李文阳,马梦迪,郭红卫. 中国科学:生命科学. 2013(10)
[10]染色体步移技术克隆已知序列侧翼启动子的研究进展[J]. 康丹,方小艳,游腾飞,王婷婷,眭安平,杨星勇. 农业生物技术学报. 2013(03)
博士论文
[1]水稻tree1增变表型的分子遗传学研究[D]. 胡兴明.中国农业科学院 2017
[2]铝胁迫下杉木无性系苗若干生理过程及转录组的研究[D]. 马志慧.福建农林大学 2015
[3]白桦BpMYB106转录因子的功能研究[D]. 周晨光.东北林业大学 2014
[4]白桦BplMYB46基因调控抗旱耐盐和次生壁形成的分子机理[D]. 国会艳.东北林业大学 2014
硕士论文
[1]转录组分析文冠果幼苗抗冷性机制[D]. 王伟.山东农业大学 2015
[2]离体加倍创造欧李多倍体种质及其鉴定[D]. 史文秀.山西农业大学 2015
[3]基于RNA-seq技术对西瓜果皮色泽差异表达基因的分析[D]. 杨侃侃.江西农业大学 2015
[4]基于重测序技术的美洲黑杨×小叶杨亲本变异位点检测分析[D]. 徐后喜.南京林业大学 2015
[5]莱茵衣藻富硒生物学特性及其转录组学研究[D]. 程雪薇.深圳大学 2015
本文编号：2918756
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