兴安落叶松咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特性分析
发布时间：2021-07-17 13:07
本研究利用兼并-PCR及RACE技术克隆了兴安落叶松（Larix gmelinii）的咖啡酸-O-甲基转移酶基因（命名为Lg COMT）,并对其基因结构和表达模式进行了分析。所克隆的Lg COMT c DNA全长为1 173 bp,包含1 092 bp的开放阅读框,编码364个氨基酸;基因组DNA全长为1 400 bp,包含3个外显子和2个内含子。系统进化分析结果显示,Lg COMT与日本落叶松、挪威云杉和北美云杉等裸子植物COMT的亲缘关系较近。表达模式分析结果显示,Lg COMT基因主要在兴安落叶松的幼茎中表达,与其功能相一致。本研究为进一步分析兴安落叶松咖啡酸-O-甲基转移酶基因的功能,表达特性及其在木质素单体生物合成中的调控机理奠定了基础。
【文章来源】：分子植物育种. 2016,14(07)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
兼并PCR及RACE-PCR产物凝胶电泳注:M:100bpmarker;1,2:兼并PCR产物;3:3'RACE-PCR产
图1兼并PCR及RACE-PCR产物凝胶电泳注:M:100bpmarker;1,2:兼并PCR产物;3:3'RACE-PCR产物;4:5'RACE-PCR产物Figure1ProductsofdegeneratePCRandRACE-PCRNote:M:100bpmarker;1,2:Productofdegennerate-PCR;3:Productof3'RACE-PCR;4:Productof5'RACE-PCR图2扩增LgCOMTcDNA和基因组DNA序列的PCR产物电泳注:M:200bpmarker;1:LgCOMTcDNA扩增产物;2:LgCOMT基因组DNA扩增产物Figure2Productsforamplificationoffull-lengthcDNAandge-nomicDNAofLgCOMTNote:M:200bpmarker;1:ProductforamplificationofLgCOMTcDNA;2:ProductforamplificationofgenomicDNAofLgCOMT多而复杂的生物学功能。木质素单体的合成由苯丙氨酸(或酪氨酸)脱氧形成肉桂酸起始，经过羟基化、甲基化及还原等一系列反应生成三种木质素单体(刘媛等,2007)。在木质素单体的生物合成过程中需要3'和5'位置的两步甲基化反应，咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeicacid-3-O-methltransferase,COMT)和咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(caffeovlCoA-3-O-methyltransferase,CCoAOM-T)是两个不同底物水平上的甲基化酶，它们催化咖啡酸、5-羟基松柏醇和5-羟基松柏醛分别生成阿魏酸、芥子醇和芥子醛，进而生成S型木质素(魏建华和宋艳茹,2001)。COMT作为木质素合成途径中的关键酶，除了参与S型木质素单体的合成外还与G型木质素转化S型木质素的反应途径密切相关。紫丁香基木质素单体多一个甲氧基基团与愈创木基木质素相比，从而多聚体中含有少量的C-C连接，由于C-C连接可使木质素结构致密(李潞滨等,2007)。前人通过遗传转化研究证实，COMT基因不同程度地参与木质素生物合成的调控(Trabuccoetal.,2013;Wengetal.,2011)。抑制COMT基因表达的二穗短柄草中，总木
分子植物育种MolecularPlantBreeding图3LgCOMT基因结构示意Figure3TheschematicdiagramofLgCOMTgenestructure图4LgCOMT的核苷酸及推测的氨基酸序列Figure4NucleotideanddeducedaminoacidsequencesofLgCOMT1092bp的开放阅读框(ORF)，编码364个氨基酸。利用ExPASy数据库在线分析软件ProtParam计算其蛋白分子量和理论等电点，分别为40.18kD和5.63。基因组DNA全长为1400bp，由3个外显子和2个内含子构成，三个外显子长分别为759bp、65bp和349bp；两个内含子长分别为91bp和136bp(图3)。LgCOMT基因编码的蛋白具有甲基转移酶典型结构(图4)，其包含S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-ad-enosyl-L-methionine,SAM)结合位点(LVDVGGGV)。1.2.2LgCOMT基因的系统进化分析利用MEGA5.0对LgCOMT基因编码的氨基酸序列与北美云杉、银杏、葡萄、拟南芥等15种植物的COMT氨基酸序列进行系统进化分析显示(图5)，兴安落叶松LgCOMT与日本落叶松(L.kaempferi)、挪威云杉(P.abies)、银杏(G.biloba)和北美云杉(P.sitc-hensis)等裸子植物COMT聚为一类，其中与日本落叶松COMT的遗传距离最近；与葡萄(V.vinifera)、丹参(S.miltiorrhiza)、苹果(M.domestica)、拟南芥(A.thaliana)和蒺藜状苜蓿(M.truncatula)等被子植物C-OMT的遗传距离相对较远。1.3兴安落叶松LgCOMT基因的组织特异性表达利用RT-PCR进行LgCOMT表达模式检测结果显示，LgCOMT在兴安落叶松幼苗的根、茎和叶组织中均有表达，幼茎和针叶中的表达量相对较高，根中的表达量最少(图6)。2讨论植物木质素合成需要多种酶的参与，其中咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)作为重要的甲基转移酶在木质素合成中充当着重要的角色。COMT是一个依赖S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基?
【参考文献】：
期刊论文
[1]丹参咖啡酸-O-甲基转移酶基因（SmCOMT1）的克隆及其分析[J]. 宋银,王东浩,吴锦斌,周露,王国栋,王喆之. 植物研究. 2012(04)
[2]可再生生物质资源——木质素的研究[J]. 李忠正. 南京林业大学学报(自然科学版). 2012(01)
[3]棉花甲基化酶基因COMT和CCoAOMT的组织特异性表达分析[J]. 吕萌,倪志勇,王娟,李波,罗淑萍,范玲. 核农学报. 2010(04)
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[5]木质素单体生物合成途径研究进展[J]. 刘媛,黄真池,曾富华,陈信波. 湛江师范学院学报. 2007(06)
[6]木质素生物合成关键酶基因的研究进展[J]. 李潞滨,刘蕾,何聪芬,董银卯,彭镇华. 分子植物育种. 2007(S1)
[7]绿竹咖啡酸-O-甲基转移酶基因（COMT）的克隆及相关分析[J]. 李雪平,高志民,彭镇华,岳永德,高健,蔡春菊,牟少华. 林业科学研究. 2007(05)
[8]木质素合成酶咖啡酸3-O-甲基转移酶（COMT）的遗传调控研究[J]. 郭昭,赵一玲,刘景利,薛永常. 分子植物育种. 2006(S2)
[9]木质素生物合成途径及调控的研究进展[J]. 魏建华,宋艳茹. 植物学报. 2001(08)
[10]毛白杨COMT基因cDNA的克隆、序列与特异性表达分析（英文）[J]. 魏建华,赵华燕,卢善发,王台,马庆虎,宋艳茹. 植物学报. 2001(03)
硕士论文
[1]东北白桦COMT1和CESA4基因克隆及反义COMT1遗传转化[D]. 吕梦燕.东北林业大学 2013
本文编号：3288234
【文章来源】：分子植物育种. 2016,14(07)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
兼并PCR及RACE-PCR产物凝胶电泳注:M:100bpmarker;1,2:兼并PCR产物;3:3'RACE-PCR产
图1兼并PCR及RACE-PCR产物凝胶电泳注:M:100bpmarker;1,2:兼并PCR产物;3:3'RACE-PCR产物;4:5'RACE-PCR产物Figure1ProductsofdegeneratePCRandRACE-PCRNote:M:100bpmarker;1,2:Productofdegennerate-PCR;3:Productof3'RACE-PCR;4:Productof5'RACE-PCR图2扩增LgCOMTcDNA和基因组DNA序列的PCR产物电泳注:M:200bpmarker;1:LgCOMTcDNA扩增产物;2:LgCOMT基因组DNA扩增产物Figure2Productsforamplificationoffull-lengthcDNAandge-nomicDNAofLgCOMTNote:M:200bpmarker;1:ProductforamplificationofLgCOMTcDNA;2:ProductforamplificationofgenomicDNAofLgCOMT多而复杂的生物学功能。木质素单体的合成由苯丙氨酸(或酪氨酸)脱氧形成肉桂酸起始，经过羟基化、甲基化及还原等一系列反应生成三种木质素单体(刘媛等,2007)。在木质素单体的生物合成过程中需要3'和5'位置的两步甲基化反应，咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeicacid-3-O-methltransferase,COMT)和咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(caffeovlCoA-3-O-methyltransferase,CCoAOM-T)是两个不同底物水平上的甲基化酶，它们催化咖啡酸、5-羟基松柏醇和5-羟基松柏醛分别生成阿魏酸、芥子醇和芥子醛，进而生成S型木质素(魏建华和宋艳茹,2001)。COMT作为木质素合成途径中的关键酶，除了参与S型木质素单体的合成外还与G型木质素转化S型木质素的反应途径密切相关。紫丁香基木质素单体多一个甲氧基基团与愈创木基木质素相比，从而多聚体中含有少量的C-C连接，由于C-C连接可使木质素结构致密(李潞滨等,2007)。前人通过遗传转化研究证实，COMT基因不同程度地参与木质素生物合成的调控(Trabuccoetal.,2013;Wengetal.,2011)。抑制COMT基因表达的二穗短柄草中，总木
分子植物育种MolecularPlantBreeding图3LgCOMT基因结构示意Figure3TheschematicdiagramofLgCOMTgenestructure图4LgCOMT的核苷酸及推测的氨基酸序列Figure4NucleotideanddeducedaminoacidsequencesofLgCOMT1092bp的开放阅读框(ORF)，编码364个氨基酸。利用ExPASy数据库在线分析软件ProtParam计算其蛋白分子量和理论等电点，分别为40.18kD和5.63。基因组DNA全长为1400bp，由3个外显子和2个内含子构成，三个外显子长分别为759bp、65bp和349bp；两个内含子长分别为91bp和136bp(图3)。LgCOMT基因编码的蛋白具有甲基转移酶典型结构(图4)，其包含S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-ad-enosyl-L-methionine,SAM)结合位点(LVDVGGGV)。1.2.2LgCOMT基因的系统进化分析利用MEGA5.0对LgCOMT基因编码的氨基酸序列与北美云杉、银杏、葡萄、拟南芥等15种植物的COMT氨基酸序列进行系统进化分析显示(图5)，兴安落叶松LgCOMT与日本落叶松(L.kaempferi)、挪威云杉(P.abies)、银杏(G.biloba)和北美云杉(P.sitc-hensis)等裸子植物COMT聚为一类，其中与日本落叶松COMT的遗传距离最近；与葡萄(V.vinifera)、丹参(S.miltiorrhiza)、苹果(M.domestica)、拟南芥(A.thaliana)和蒺藜状苜蓿(M.truncatula)等被子植物C-OMT的遗传距离相对较远。1.3兴安落叶松LgCOMT基因的组织特异性表达利用RT-PCR进行LgCOMT表达模式检测结果显示，LgCOMT在兴安落叶松幼苗的根、茎和叶组织中均有表达，幼茎和针叶中的表达量相对较高，根中的表达量最少(图6)。2讨论植物木质素合成需要多种酶的参与，其中咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)作为重要的甲基转移酶在木质素合成中充当着重要的角色。COMT是一个依赖S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基?
【参考文献】：
期刊论文
[1]丹参咖啡酸-O-甲基转移酶基因（SmCOMT1）的克隆及其分析[J]. 宋银,王东浩,吴锦斌,周露,王国栋,王喆之. 植物研究. 2012(04)
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[4]棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析[J]. 倪志勇,吕萌,李波,王娟,白岩,范玲. 中国农业科学. 2010(06)
[5]木质素单体生物合成途径研究进展[J]. 刘媛,黄真池,曾富华,陈信波. 湛江师范学院学报. 2007(06)
[6]木质素生物合成关键酶基因的研究进展[J]. 李潞滨,刘蕾,何聪芬,董银卯,彭镇华. 分子植物育种. 2007(S1)
[7]绿竹咖啡酸-O-甲基转移酶基因（COMT）的克隆及相关分析[J]. 李雪平,高志民,彭镇华,岳永德,高健,蔡春菊,牟少华. 林业科学研究. 2007(05)
[8]木质素合成酶咖啡酸3-O-甲基转移酶（COMT）的遗传调控研究[J]. 郭昭,赵一玲,刘景利,薛永常. 分子植物育种. 2006(S2)
[9]木质素生物合成途径及调控的研究进展[J]. 魏建华,宋艳茹. 植物学报. 2001(08)
[10]毛白杨COMT基因cDNA的克隆、序列与特异性表达分析（英文）[J]. 魏建华,赵华燕,卢善发,王台,马庆虎,宋艳茹. 植物学报. 2001(03)
硕士论文
[1]东北白桦COMT1和CESA4基因克隆及反义COMT1遗传转化[D]. 吕梦燕.东北林业大学 2013
本文编号：3288234
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