毛竹KdsD蛋白的原核表达纯化及酶学性质研究
发布时间：2021-08-24 09:44
毛竹属于禾本科竹亚科单子叶植物,其细胞壁主要成分由纤维素和果胶组成。植物果胶中的2-酮-3-脱氧辛糖酸（KDO）是非常保守的八碳糖,主要通过KDO合成途径合成。该途径中阿拉伯糖-5-磷酸异构酶（Arabinose-5-phosphate isomerase,KdsD）[EC:5.3.1.13]是KOD合成途径的第一个关键的限速酶。但禾本科毛竹中KdsD的结构和生物学功能尚不清楚。本研究以毛竹为研究对象,进行了初步研究,结论如下;1.成功构建得到毛竹KdsD蛋白的原核表达载体,经过诱导、表达,成功获得了大量重组蛋白的可溶性表达。2.表达产物经Ni-NTA亲和层析和分子筛层析（SEC）方法进行酶蛋白的分离纯化步骤,得到纯度85%以上的高纯度酶;分子筛层析和BN-PAGE结果发现纯化后的目的蛋白KdsD在溶液中主要以多聚体、二聚体和单体形式存在,这同微生物来源KdsD酶在溶液中以四聚体形式存在很大差异;进一步使用Western blotting和MALDI-TOF MASS技术对纯化的蛋白进行鉴定。3.测定了毛竹KdsD酶学性质,证明该酶催化反应的最适pH值为8.5,最适作用温度为37℃,各...
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
细胞壁RG-II的结构
辛糖酸-8 磷酸(KDO-8-P)与无机磷酸（Pi）；3) KDO-8-P 在 2-酮-3-脱氧辛糖 磷酸化酶（Kdo-8-P phosphatase, KdsC）作用下去磷酸形成 2-酮-3-脱氧辛糖KDO）；4) KDO 与 CTP 在 2-酮-3-脱氧辛糖酸胞苷酰转移酶（CMP-Kdothetase）催化下，KDO 被激活与 CMP 偶联形成 CMP-KDO；5)最后由 KDO酶（Kdo transferase, KdtA）介导，KDO 转移到磷脂 A，连接类脂 A 与 O侧链后插入革兰氏阴性菌细胞壁外膜的脂多糖（LPS）中，CMP 脱落，催化 KDO 的途径中所涉及到的 5 种酶，在此途径中都很保守，也就是说 KDO是很保守的，继而表明 KDO 也是一种很保守的八碳糖，LIYI 在 2009 年攻HD 学位时的论文中也提到了此途径的存在[27-30]，如图 1.2。在植物中，KDO化过程以及合成途径也是很保守的，涉及的 KdsD，KdsA，KdsB 酶与细菌具有同源性，且合成途径发生在细胞溶胶质中[31,32]。
E.coliKdsD和bfAPI结构
【参考文献】：
期刊论文
[1]花生RuBPCase小亚基基因的克隆与序列分析[J]. 徐自力,应濠泽,余佳宁,祝锦晶,梁莉佳,沈广圳,张丽娜,杜照奎. 广东农业科学. 2014(24)
[2]毛竹KDO8PS的原核表达纯化及晶体生长[J]. 张凤雪,徐英武,张智俊,肖冬长,王超莉,屈亚平. 浙江农林大学学报. 2014(04)
[3]拟南芥SEPALLATA3蛋白质原核表达与纯化[J]. 周佳平,林新春,徐英武. 浙江农林大学学报. 2014(01)
[4]亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用[J]. 陈爱春,彭伟,汪生鹏. 中国生物工程杂志. 2012(12)
[5]鸡毒霉形体黏附素截短蛋白表达条件的优化[J]. 高俊伟,毕丁仁,胡思顺,彭秀丽. 华中农业大学学报. 2007(04)
[6]蛋白质结构研究[J]. 林亚静,刘志杰,龚为民. 生命科学. 2007(03)
[7]果胶制备的研究进展[J]. 魏海香,木泰华,孙艳丽,崔海信,邬应龙. 食品研究与开发. 2006(04)
[8]果胶类多糖的研究进展[J]. 孙元琳,汤坚. 食品与机械. 2004(06)
[9]温度对重组大肠杆菌生长及外源蛋白表达的影响[J]. 叶姣,陈长华,夏杰,付水林,杨雅琴. 华东理工大学学报. 2002(04)
[10]大肠杆菌BL21（DE3）中表达重组蛋白的研究[J]. 陆海,吴薇,曾庆银,李义,蒋湘宁,王沙生. 北京林业大学学报. 2001(06)
博士论文
[1]福氏志贺氏菌可溶性蛋白复合物研究[D]. 牛畅.浙江大学 2013
[2]绿竹笋采前品质相关影响因素和采后生理特性研究[D]. 肖丽霞.中国农业大学 2005
[3]浙闽山区毛竹高效经营技术与参与式发展模式研究[D]. 金爱武.南京林业大学 2004
硕士论文
[1]甲酸转运蛋白FocA分子结构和功能机制的研究[D]. 黄永鉴.清华大学 2010
[2]植物激素脱落酸受体的表达，纯化和晶体学研究[D]. 樊鹤.清华大学 2010
[3]L-阿拉伯糖异构酶的酶学性质及酶法制备塔格糖研究[D]. 翁玮慧.江南大学 2006
本文编号：3359753
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
细胞壁RG-II的结构
辛糖酸-8 磷酸(KDO-8-P)与无机磷酸（Pi）；3) KDO-8-P 在 2-酮-3-脱氧辛糖 磷酸化酶（Kdo-8-P phosphatase, KdsC）作用下去磷酸形成 2-酮-3-脱氧辛糖KDO）；4) KDO 与 CTP 在 2-酮-3-脱氧辛糖酸胞苷酰转移酶（CMP-Kdothetase）催化下，KDO 被激活与 CMP 偶联形成 CMP-KDO；5)最后由 KDO酶（Kdo transferase, KdtA）介导，KDO 转移到磷脂 A，连接类脂 A 与 O侧链后插入革兰氏阴性菌细胞壁外膜的脂多糖（LPS）中，CMP 脱落，催化 KDO 的途径中所涉及到的 5 种酶，在此途径中都很保守，也就是说 KDO是很保守的，继而表明 KDO 也是一种很保守的八碳糖，LIYI 在 2009 年攻HD 学位时的论文中也提到了此途径的存在[27-30]，如图 1.2。在植物中，KDO化过程以及合成途径也是很保守的，涉及的 KdsD，KdsA，KdsB 酶与细菌具有同源性，且合成途径发生在细胞溶胶质中[31,32]。
E.coliKdsD和bfAPI结构
【参考文献】：
期刊论文
[1]花生RuBPCase小亚基基因的克隆与序列分析[J]. 徐自力,应濠泽,余佳宁,祝锦晶,梁莉佳,沈广圳,张丽娜,杜照奎. 广东农业科学. 2014(24)
[2]毛竹KDO8PS的原核表达纯化及晶体生长[J]. 张凤雪,徐英武,张智俊,肖冬长,王超莉,屈亚平. 浙江农林大学学报. 2014(04)
[3]拟南芥SEPALLATA3蛋白质原核表达与纯化[J]. 周佳平,林新春,徐英武. 浙江农林大学学报. 2014(01)
[4]亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用[J]. 陈爱春,彭伟,汪生鹏. 中国生物工程杂志. 2012(12)
[5]鸡毒霉形体黏附素截短蛋白表达条件的优化[J]. 高俊伟,毕丁仁,胡思顺,彭秀丽. 华中农业大学学报. 2007(04)
[6]蛋白质结构研究[J]. 林亚静,刘志杰,龚为民. 生命科学. 2007(03)
[7]果胶制备的研究进展[J]. 魏海香,木泰华,孙艳丽,崔海信,邬应龙. 食品研究与开发. 2006(04)
[8]果胶类多糖的研究进展[J]. 孙元琳,汤坚. 食品与机械. 2004(06)
[9]温度对重组大肠杆菌生长及外源蛋白表达的影响[J]. 叶姣,陈长华,夏杰,付水林,杨雅琴. 华东理工大学学报. 2002(04)
[10]大肠杆菌BL21（DE3）中表达重组蛋白的研究[J]. 陆海,吴薇,曾庆银,李义,蒋湘宁,王沙生. 北京林业大学学报. 2001(06)
博士论文
[1]福氏志贺氏菌可溶性蛋白复合物研究[D]. 牛畅.浙江大学 2013
[2]绿竹笋采前品质相关影响因素和采后生理特性研究[D]. 肖丽霞.中国农业大学 2005
[3]浙闽山区毛竹高效经营技术与参与式发展模式研究[D]. 金爱武.南京林业大学 2004
硕士论文
[1]甲酸转运蛋白FocA分子结构和功能机制的研究[D]. 黄永鉴.清华大学 2010
[2]植物激素脱落酸受体的表达，纯化和晶体学研究[D]. 樊鹤.清华大学 2010
[3]L-阿拉伯糖异构酶的酶学性质及酶法制备塔格糖研究[D]. 翁玮慧.江南大学 2006
本文编号：3359753
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