漆树GST基因家族的筛选及Lambda GST基因的克隆与功能分析
发布时间：2022-01-01 02:08
漆树（Toxicodendron vernicifluum（Stokes）F.A.Barkl.）是我国最古老的经济树种之一,从其树皮割取的生漆是优良的天然涂料。由于气候水热条件限制和利用过度、保护不足,致使我国的漆树资源和生漆产量在不断减少。谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione Stransferases,GSTs,E.C.2.5.1.18）广泛存在于细胞质中,与植物抗逆性密切相关,在清除生物或非生物胁迫产生的氧化损伤中起着重要作用,所以研究漆树谷胱甘肽S-转移酶对揭示漆树抗逆机理具有非常重要的意义。本研究以漆树主栽品种‘大红袍’为试验材料,以漆树谷胱甘肽S-转移酶为研究对象,在漆树转录组数据的基础上,初步筛选出38条GSTs基因,对其序列进行了分析,并对其中Lambda GST基因进行克隆、表达及其功能的研究,主要结果如下:1.漆树GST基因家族分为φ（Phi,F）、τ（Tau,U）、θ（Theta,T）、ζ（Zeta,Z）、λ（Lambda,L）、脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbatereductase,DHAR）6个亚类;漆树Tv GSTs基因序列的核苷酸长度...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线
西北农林科技大学硕士学位论文22如表2-4所示，TvGSTZ1可能为细胞膜组成成分，TvDHAR1可能为叶绿体基质、叶绿体包膜、类囊体膜组织的组成成分，其余TvGSTs基因GO功能注释结果细胞学组件均为细胞质。谷胱甘肽代谢过程为所有TvGSTs基因的生物学途径；Tau（U）亚类TvGSTs基因具有毒素分解代谢的生物学途径；Zeta（Z）亚类TvGSTs基因具有芳香族氨基酸家族代谢的生物学途径；Lambda（L）亚类TvGSTs基因具有蛋白质谷胱甘肽化的生物学途径；TvDHAR1基因生物学途径较为复杂，具有毒素分解代谢、对细胞分裂素的反应、对环戊烯酮的反应及蛋白质谷胱甘肽化等生物学途径；TvDHAR1基因具有谷胱甘肽脱氢酶（抗坏血酸）活性生物学途径。TvGSTU12推测具有裂解酶的分子功能，其余TvGSTs基因所编码的蛋白均具有谷胱甘肽转移酶活性；TvGSTF7和TvGSTF11所编码的蛋白质可能为靶向线粒体的蛋白质；TvGSTU7和TvGSTU10所编码的蛋白具有乳酰谷胱甘肽裂解酶活性；TvDHAR2、TvDHAR3、TvDHAR4、TvDHAR5、TvDHAR6、TvDHAR7均可能参与氧化还原过程。因此，不同亚类TvGSTs基因GO功能注释在细胞学组件、生物学途径及分子功能存在较大的差异。2.2.7漆树GST基因表达分析注：L代表叶；R代表茎；S代表根Lforleaves;Rforstems;Sforroots图2-3漆树GST基因的表达模式ExpressionpatternsofGSTgenesinToxicodendronvernicifluum
西北农林科技大学硕士学位论文32亮度比约为2:1。经核酸浓度测定仪测定后OD260/OD280=1.887，说明无蛋白质或者酚类物质的污染；OD260/OD230=2.135，表明无碳水化合物、盐的影响。可进行后续试验。图3-1漆树幼苗总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.3-1AgarosegelelectrophoresisvalidationoftotalRNAfromT.vernicifluum3.3.2漆树LambdaGST基因的克隆对漆树转录组进行测序和基因功能注释，获得一种候选GST基因。利用NCBIORFFinder对其查找后发现，该序列包含1个完整的ORF，根据该基因的序列信息，设计1对特异性引物，扩增并构建克隆表达载体，PCR产物长度约为700bp，电泳结果如图3-2和图3-3所示。经测序得到漆树GST基因的cDNA序列大小为1259bp，包含漆树GST基因完整的ORF序列，大小为711bp，将其命名为TvGST7（GenBank登录号:MK956145）。TvGST7基因cDNA的核苷酸序列及对应氨基酸序列如图3-4所示。图3-2PCR扩增结果图图3-3TvGST7基因的菌落PCRFig.3-2PCRamplificationresultofTvGST7geneFig.3-3PCRidentificationoncolonyofTvGST7gene1.PCR全长扩增产物；M.DL2000DNAMaker2.阳性克隆；M.DL2000DNAMakeramplificationproduct;M.DL2000DNAMakerPositiveclone;M.DL2000DNAMaker
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国古代生漆加工及利用史略[J]. 何学高,黄晓华. 东北农业大学学报(社会科学版). 2019(05)
[2]中国古代漆树栽培与地理分布考究[J]. 何学高,卜元坤,杨文栋,谢冬冬,黄晓华. 中国生漆. 2019(03)
[3]日本野漆树的组织培养[J]. 李锦宇,何小帆,李旦,刘树娜,邹家通,和润喜,何承忠. 植物生理学报. 2019(01)
[4]种子不同处理方法对漆树幼苗生长的影响[J]. 冯小芹,胡勐鸿,吕寻. 西南林业大学学报(自然科学). 2018(06)
[5]漆树TvFAD2基因的克隆与表达分析[J]. 郭崇炎,王志龙,韦鹏飞,苏莹,黎芳梅,陈秋红. 分子植物育种. 2018(19)
[6]棉花GhVHA-A基因的原核表达及其重组大肠杆菌的抗逆性分析[J]. 刘娜,倪志勇,芮存,李娟,陈全家,曲延英. 西北植物学报. 2018(01)
[7]秦巴山区漆树nrDNAITS和cpDNA序列分子进化特点的分析[J]. 柏国清,李为民,陈昊,黎斌,李思锋. 植物研究. 2017(04)
[8]小木漆组织培养技术研究[J]. 罗一然,韩国伟,张雪,李旦,刘树娜,赵月明,和润喜,何承忠. 西南林业大学学报(自然科学). 2017(03)
[9]芥菜型油菜中SK2型脱水蛋白的表达对大肠杆菌抗逆性的影响[J]. 孙雅慧,罗桂花,柴团耀,王慧春,徐进. 山西农业大学学报(自然科学版). 2016(04)
[10]漆树的药理研究进展[J]. 潘宇,李顺祥,傅超凡. 中成药. 2014(03)
硕士论文
[1]火把梨谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与功能分析[D]. 王光勇.昆明理工大学 2012
本文编号：3561440
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线
西北农林科技大学硕士学位论文22如表2-4所示，TvGSTZ1可能为细胞膜组成成分，TvDHAR1可能为叶绿体基质、叶绿体包膜、类囊体膜组织的组成成分，其余TvGSTs基因GO功能注释结果细胞学组件均为细胞质。谷胱甘肽代谢过程为所有TvGSTs基因的生物学途径；Tau（U）亚类TvGSTs基因具有毒素分解代谢的生物学途径；Zeta（Z）亚类TvGSTs基因具有芳香族氨基酸家族代谢的生物学途径；Lambda（L）亚类TvGSTs基因具有蛋白质谷胱甘肽化的生物学途径；TvDHAR1基因生物学途径较为复杂，具有毒素分解代谢、对细胞分裂素的反应、对环戊烯酮的反应及蛋白质谷胱甘肽化等生物学途径；TvDHAR1基因具有谷胱甘肽脱氢酶（抗坏血酸）活性生物学途径。TvGSTU12推测具有裂解酶的分子功能，其余TvGSTs基因所编码的蛋白均具有谷胱甘肽转移酶活性；TvGSTF7和TvGSTF11所编码的蛋白质可能为靶向线粒体的蛋白质；TvGSTU7和TvGSTU10所编码的蛋白具有乳酰谷胱甘肽裂解酶活性；TvDHAR2、TvDHAR3、TvDHAR4、TvDHAR5、TvDHAR6、TvDHAR7均可能参与氧化还原过程。因此，不同亚类TvGSTs基因GO功能注释在细胞学组件、生物学途径及分子功能存在较大的差异。2.2.7漆树GST基因表达分析注：L代表叶；R代表茎；S代表根Lforleaves;Rforstems;Sforroots图2-3漆树GST基因的表达模式ExpressionpatternsofGSTgenesinToxicodendronvernicifluum
西北农林科技大学硕士学位论文32亮度比约为2:1。经核酸浓度测定仪测定后OD260/OD280=1.887，说明无蛋白质或者酚类物质的污染；OD260/OD230=2.135，表明无碳水化合物、盐的影响。可进行后续试验。图3-1漆树幼苗总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.3-1AgarosegelelectrophoresisvalidationoftotalRNAfromT.vernicifluum3.3.2漆树LambdaGST基因的克隆对漆树转录组进行测序和基因功能注释，获得一种候选GST基因。利用NCBIORFFinder对其查找后发现，该序列包含1个完整的ORF，根据该基因的序列信息，设计1对特异性引物，扩增并构建克隆表达载体，PCR产物长度约为700bp，电泳结果如图3-2和图3-3所示。经测序得到漆树GST基因的cDNA序列大小为1259bp，包含漆树GST基因完整的ORF序列，大小为711bp，将其命名为TvGST7（GenBank登录号:MK956145）。TvGST7基因cDNA的核苷酸序列及对应氨基酸序列如图3-4所示。图3-2PCR扩增结果图图3-3TvGST7基因的菌落PCRFig.3-2PCRamplificationresultofTvGST7geneFig.3-3PCRidentificationoncolonyofTvGST7gene1.PCR全长扩增产物；M.DL2000DNAMaker2.阳性克隆；M.DL2000DNAMakeramplificationproduct;M.DL2000DNAMakerPositiveclone;M.DL2000DNAMaker
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国古代生漆加工及利用史略[J]. 何学高,黄晓华. 东北农业大学学报(社会科学版). 2019(05)
[2]中国古代漆树栽培与地理分布考究[J]. 何学高,卜元坤,杨文栋,谢冬冬,黄晓华. 中国生漆. 2019(03)
[3]日本野漆树的组织培养[J]. 李锦宇,何小帆,李旦,刘树娜,邹家通,和润喜,何承忠. 植物生理学报. 2019(01)
[4]种子不同处理方法对漆树幼苗生长的影响[J]. 冯小芹,胡勐鸿,吕寻. 西南林业大学学报(自然科学). 2018(06)
[5]漆树TvFAD2基因的克隆与表达分析[J]. 郭崇炎,王志龙,韦鹏飞,苏莹,黎芳梅,陈秋红. 分子植物育种. 2018(19)
[6]棉花GhVHA-A基因的原核表达及其重组大肠杆菌的抗逆性分析[J]. 刘娜,倪志勇,芮存,李娟,陈全家,曲延英. 西北植物学报. 2018(01)
[7]秦巴山区漆树nrDNAITS和cpDNA序列分子进化特点的分析[J]. 柏国清,李为民,陈昊,黎斌,李思锋. 植物研究. 2017(04)
[8]小木漆组织培养技术研究[J]. 罗一然,韩国伟,张雪,李旦,刘树娜,赵月明,和润喜,何承忠. 西南林业大学学报(自然科学). 2017(03)
[9]芥菜型油菜中SK2型脱水蛋白的表达对大肠杆菌抗逆性的影响[J]. 孙雅慧,罗桂花,柴团耀,王慧春,徐进. 山西农业大学学报(自然科学版). 2016(04)
[10]漆树的药理研究进展[J]. 潘宇,李顺祥,傅超凡. 中成药. 2014(03)
硕士论文
[1]火把梨谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与功能分析[D]. 王光勇.昆明理工大学 2012
本文编号：3561440
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