转AhDREB1基因杂种毛白杨盐胁迫响应与生物安全性研究

发布时间：2022-08-11 14:28

　　培育杨树耐盐新品种对于加强我国盐碱地的综合开发与利用,以及满足我国对杨树用材的需求具有重要意义。利用基因工程技术进行育种,能够克服传统育种方法周期较长、针对性不强的缺点。已有研究表明,异源转化AhDREB1转录因子在一定程度上可提高杨树的耐盐能力,但外源基因是否会造成非预期效应及转基因植株是否具备田间的长期稳定性和安全性尚不确定,能否进一步提高AhDREB1转基因毛白杨的耐盐能力也有待深入研究。为此,本研究以AhDREB1转基因毛白杨组培苗、大田种植苗为材料,通过盆栽盐胁迫试验分析转基因植株和非转基因植株在不同程度盐胁迫下的生理生化指标,并筛选出在非盐胁迫和盐胁迫下的转基因毛白杨和非转基因对照的差异表达基因,分析这些差异基因可能对受体植株的影响以及受外源基因调控的耐盐基因的功能,研究AhDREB1的耐盐机理;为了进一步提高受体植株的耐盐能力,以84K杨为受体植株,在AhDREB1转录因子的基础上,克隆了柽柳TaMnSOD、TaLea、拟南芥AtNHX3个不同耐盐途径的功能基因,构建多基因共表达载体,进行遗传转化;对比分析田间种植10年的AhDREB1转基因毛白杨的外源基因存在情况、表达... 

【文章页数】：154 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
本文缩略词(Abbreviation)
引言
1. 国内外耐盐转基因育种相关研究进展
    1.1 植物的耐盐机理研究
        1.1.1 植物的耐盐机制
        1.1.2 不同耐盐机制的相关基因
    1.2 杨树耐盐碱相关转基因育种研究
        1.2.1 Na~+/H~+逆向蛋白运转基因
        1.2.2 活性氧清除的酶类基因
        1.2.3 胚胎发育晚期丰富蛋白
        1.2.4 DREB转录因子
        1.2.5 多基因转化育种
    1.3 外源基因的非预期效应
        1.3.1 外源基因非预期效应的类型
        1.3.2 外源基因非预期效应的评估内容及检测方法
    1.4 转基因植株田间稳定性及安全性
        1.4.1 转基因林木田间外源基因表达稳定性
        1.4.2 转基因植株的安全性监测
    1.5 研究内容、技术路线与拟解决的主要问题
        1.5.1 研究内容
        1.5.2 技术路线图
        1.5.3 拟解决问题
2. AhDREB1转基因毛白杨耐盐机理及非预期效应的分析
    2.1 材料和方法
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 盆栽盐胁迫试验设计
        2.1.3 基质盐分的测定
        2.1.4 植株增长量的测定
        2.1.5 叶绿素含量和光合参数测定
        2.1.6 电解质渗透率(RCE)和丙二醛(MDA)的测定
        2.1.7 脯氨酸、超氧物歧化酶、过氧化物酶活性的测定
        2.1.8 AhDREB1转基因毛白杨cDNA文库建立和转录组测序
    2.2 结果与分析
        2.2.1 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因毛白杨生长量
        2.2.2 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因毛白杨REC和MDA的含量
        2.2.3 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因毛白杨叶片的Pro含量,SOD活性,POD活性、叶绿素含量变化的测定结果
        2.2.4 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因光合参数测定
        2.2.5 转录组测序结果
        2.2.6 差异基因的筛选及注释
    2.3 小结
3 多耐盐碱基因共转化载体构建及遗传转化银腺杨84K
    3.1 试验材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌种与载体
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 溶液、培养基配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 柽柳TaMnSOD等耐盐碱基因及拟南芥RD29A基因启动子克隆
        3.2.2 多基因共转化载体构建
        3.2.3 多基因共表达载体遗传转化银腺杨84K
    3.3 结果与分析
        3.3.1 TaMnSOD,TaLEA,AtNHX基因及RD29A启动子片段的克隆
        3.3.2 克隆片段测序结果与公布序列结果对比
        3.3.3 多基因共转化载体3452A-SDLN的PCR验证
        3.3.4 多基因共转化载体3452A-SDLN的测序验证
        3.3.5 多耐盐碱基因遗传共转化银腺杨84K
    3.4 小结
4. AhDREB1转基因植株多年田间稳定性及安全性监测试验
    4.1 材料与方法
        4.1.1 试验材料与试验地信息
        4.1.2 转基因毛白杨外源基因稳定性的检测
        4.1.3 转基因毛白杨化感作用分析
        4.1.4 转基因毛白杨林下土壤微生物多样性检测
        4.1.5 外源基因水平转移监测
        4.1.6 外源基因在叶片中的降解速度检测
        4.1.7 转基因毛白杨花粉可育性分析
        4.1.8 数据分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 田间多年种植后外源基因稳定性检测结果
        4.2.2 转基因杨树叶片化感作用检测结果
        4.2.3 对转基因杨树外源基因水平转移情况分析
        4.2.4 转基因杨树林下土壤微生物多样性检测
        4.2.5 转基因杨树叶片降解叶片中外源基因残留情况监测
        4.2.6 对成熟转基因毛白杨花粉可育性分析
    4.3 小结
5 讨论
    5.1 AhDREB1转基因毛白杨的耐盐机制及非预期效应分析
    5.2 多耐盐基因共转化对受体植株耐盐能力的改良的效果
    5.3 田间多年种植的转基因毛白杨外源基因表达量下降
    5.4 田间多年种植的AhDREB1转基因毛白杨没有发现潜在危害
6 结论
参考文献
附录Ⅰ
附录Ⅱ
个人简介
导师简介
获得成果目录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]平欧杂交榛CBF/DREB1转录因子ChaCBF1基因的克隆与功能分析[J]. 雷恒久,苏淑钗,马履一,马仲.  北京林业大学学报. 2016(10)
[2]5种沉水植物对斜生栅藻的化感作用[J]. 闫志强,宋本如,刘黾,刘燕,吴小业,李洁珊,林燕珍,冯翊果,陈章和,赵建刚.  应用与环境生物学报. 2015(01)
[3]NaCl胁迫对3个杨树无性系幼苗生长和光合生理的影响[J]. 王秀伟,贾桂梅,毛子军,孙涛,袁显磊.  植物研究. 2015(01)
[4]南林895杨离体培养及耐盐基因GmNHX1的转化[J]. 孙伟博,杨立恒,诸葛强.  南方农业学报. 2013(08)
[5]盐胁迫对不同品系杨树幼苗生长和叶绿素荧光的效应[J]. 武传兰,隆小华,金善钊,刘玲,王长海,刘兆普.  生态学杂志. 2012(06)
[6]转基因作物的非预期效应及其检测[J]. 张焕春,陈笑芸,汪小福,杨桂玲,徐俊锋,李玥莹.  浙江农业学报. 2012(01)
[7]农杆菌vir基因诱导因子研究进展[J]. 邹智.  中国生物工程杂志. 2011(07)
[8]植物非生物逆境胁迫DREB/CBF转录因子的研究进展[J]. 李科友,朱海兰.  林业科学. 2011(01)
[9]紫花苜蓿种质耐盐性综合评价及盐胁迫下的生理反应[J]. 李源,刘贵波,高洪文,孙桂枝,赵海明,谢楠.  草业学报. 2010(04)
[10]林木基因组及功能基因克隆研究概述[J]. 尹佟明.  遗传. 2010(07)

博士论文
[1]胡杨响应盐胁迫与离子平衡调控信号网络研究[D]. 孙健.北京林业大学 2011
[2]ATPase与杨树耐盐性形成机制研究[D]. 马秀英.北京林业大学 2010
[3]基因枪转多基因杨树的获得[D]. 王建革.中国林业科学研究院 2006

硕士论文
[1]转chlAPX基因杨树对逆境胁迫的响应[D]. 郎洪岩.山东师范大学 2014
[2]尾矿废弃地土壤中解磷菌的筛选、鉴定和特性研究[D]. 田江.北京林业大学 2014
[3]转TaLEA基因山新杨耐盐碱性分析[D]. 孙延爽.东北林业大学 2014
[4]基因芯片检测转基因水稻非预期效应技术和方法的探索[D]. 赵洁.中国农业科学院 2013
[5]多基因植物转化载体对烟草和欧美杨107杨的遗传转化[D]. 任亚超.河北农业大学 2013
[6]毛白杨杂种外源基因稳定性及对土壤微生物的影响[D]. 魏冰.北京林业大学 2010
[7]转耐盐相关基因山新杨的抗逆性分析[D]. 王雷.东北林业大学 2009
[8]多基因植物表达载体构建方法的研究[D]. 孙全喜.山东农业大学 2008
[9]农杆菌介导HbNHX1基因遗传转化小青杨的研究[D]. 杨晓妮.东北师范大学 2008
[10]转Lea基因小黑杨花粉植株抗旱、耐盐性分析[D]. 白爽.东北林业大学 2007



本文编号：3674833