小黑杨PsnWRKY70基因胁迫应答信号转导机制研究

发布时间：2022-08-11 18:55

　　WRKY蛋白广泛参与调控植物的生长、发育、衰老以及胁迫应答等生物进程,是最重要的植物胁迫应答转录因子家族之一,因此,WRKY转录因子的功能研究及其胁迫应答机制研究意义重大。根据前期的转录组测序结果,选取了来自小黑杨（Populus simonii×Populusnigra）WRKY超家族Group Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚家族的20条盐胁迫应答PsnWRKY基因进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。结果表明,PsnWRKY70基因（Potri.016G137900）既能响应生物胁迫又能响应非生物胁迫。为了进一步探究小黑杨WRKY Group Ⅲ亚家族成员——PsnWRKY70基因/PsnWRKY70转录因子在生物与非生物胁迫应答进程中的功能及其胁迫应答机制,本研究开展了酵母单杂交、酵母双杂交、遗传转化、抗逆性分析以及转录组测序等一系列的分子生物学及生理学实验。首先,利用染色体步移法克隆了Psn WKY70基因的启动子,对其测序并进行序列分析后发现,PsnWRKY70基因的启动子（转录起始位点上游2372bp的序列）区含有大量的胁迫应答相关的顺式作用元件（例如W-box、GT1、MYBST1、M... 

【文章页数】：163 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 前言
    1.2 WRKY转录因子
    1.3 W-box元件
    1.4 作用于WRKY转录因子/WRKY基因的蛋白质
    1.5 WRKY转录因子研究概况
        1.5.1 WRKY转录因子在植物生物胁迫应答进程中的作用
        1.5.2 WRKY转录因子在植物非生物胁迫应答进程中的作用
        1.5.3 WRKY转录因子在植物的其他生物进程中的作用
    1.6 WRKY转录因子的作用特点
    1.7 植物启动子研究
        1.7.1 植物启动子简介
        1.7.2 植物启动子类型
        1.7.3 植物启动子研究现状
    1.8 本研究的主要内容与技术路线
        1.8.1 主要内容
        1.8.2 技术路线
2 生物及非生物胁迫条件下PsnWRKY基因的时序表达
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 生物胁迫所用菌株
        2.1.3 主要仪器设备与试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 PsnWRKY基因家族成员的鉴定及亚细胞定位预测
        2.2.2 多序列比对与进化树的构建
        2.2.3 生物与非生物胁迫处理
        2.2.4 RNA的提取、cDNA的合成以及qRT-PCR
    2.3 结果与分析
        2.3.1 PsnWRKY基因及相应蛋白的特征
        2.3.2 多序列比对与进化分析
        2.3.3 内参基因的评价与选择
        2.3.4 不同胁迫条件下20条PsnWRKY基因表达量的时序变化
    2.4 讨论与小结
3 小黑杨PsnWRKY70基因启动子功能研究及酵母单杂交
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验方法
    3.2 结果与分析
        3.2.1 PsnWRKY70启动子的克隆及转录起始位点的确定
        3.2.2 小黑杨cDNA文库的构建及质量检测
        3.2.3 酵母单杂交筛选Psn WRKY70基因的上游调控因子
        3.2.4 植物细胞中验证酵母单杂交筛选结果
    3.3 讨论与小结
4 酵母双杂交筛选PsnWRKY70的互作蛋白
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验方法
    4.2 结果与分析
        4.2.1 诱饵载体的构建
        4.2.2 诱饵载体的自激活检测
        4.2.3 WRKY蛋白在酵母细胞中的表达情况
        4.2.4 pGBKT7-WRKY与pGADT7-cDNA共转化后的筛选
        4.2.5 回转验证结果
        4.2.6 阳性克隆所携cDNA片段的生物信息学分析
        4.2.7 互作蛋白的GST-pull down体外验证
    4.3 讨论与小结
5 小黑杨PsnWRKY70基因的功能研究
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 实验方法
    5.2 结果与分析
        5.2.1 PsnWRKY70序列的生物信息学分析
        5.2.2 PsnWRKY70基因在小黑杨不同组织部位的表达分析
        5.2.3 PsnWRKY70基因的克隆及植物表达载体构建
        5.2.4 转PsnWRKY70基因小黑杨的获得及验证
        5.2.5 转基因小黑杨的抗逆性分析
        5.2.6 盐胁迫下转基因小黑杨转录组测序分析
    5.3 讨论与小结
讨论
结论
工作展望
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
附件



本文编号：3675204