巴西橡胶树PEBP家族成员的克隆及功能分析
发布时间：2023-02-23 10:10
开花是高等植物延续后代的一个非常重要的过程。研究表明编码磷脂酰乙醇胺结合蛋白的PEBP基因家族成员在高等植物中对开花转变的调控起着关键的作用。橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)属于大戟科多年生木本植物,是目前7500多种产胶植物中最重要的天然橡胶生产者。橡胶树高产、优质、抗病、抗逆境胁迫新品种的选育一直以来都依赖于传统的杂交育种,但由于橡胶树生长缓慢,从胚后发育的童期到开花需要很多年的时间,而且有些性状只有在成年期才能表现出来,这将严重阻碍橡胶树育种的进程。因此,分子手段的实施对新品种选育和改良、缩短育种进程将起到非常重要的作用。在本研究中,橡胶树PEBP基因家族成员的克隆及其生物学功能的研究和探索,明确其在橡胶树开花转变过程中的作用,为利用分子育种技术加快橡胶树新品的培育奠定基础。我们的研究结果主要有以下几方面:1.我们从橡胶树中一共克隆了 8个PEBP基因家族成员,分别命名为HbFT1、HbFT2、HbTFL1-1、HbTFL1-2、HbTFL1-3、HbCEN1、HbCEN2 和 HbMFT1。除了HbCEN1基因以外(它包含4个外显子和4个内含...
【文章页数】：154 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 自主调控途径
1.2 春化途径
1.3 光周期调控途径
1.4 GA调控途径
1.5 花成素
1.6 拟南芥FT基因表达调控
1.7 不同植物中FT同源基因的功能
1.8 PEBP家族
1.9 TFL1/CEN-LIKE基因
1.10 TFL1/CEN-LIKE基因调控开花机理
1.11 橡胶树概况
1.12 研究意义
1.13 本研究技术路线
2 实验材料与方法
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 实验所用的菌体及载体
2.1.3 实验器材
2.1.4 常用的试剂与药品
2.1.5 引物
2.2 实验方法
2.2.1 PEBP家族成员的获得
2.2.2 引物设计
2.2.3 巴西橡胶树RNA的提取
2.2.4 总RNA的消化及纯化
2.2.5 RNA纯度和质量检测
2.2.6 反转录
2.2.7 PEBP 3' UTR的获得
2.2.8 3'RACE产物胶回收
2.2.9 回收片段的TA连接
2.2.10 菌液PCR阳性检测和测序
2.2.11 PEBP家族成员5'UTR的获得
2.2.12 巴西橡胶树基因组DNA提取(用于大量提取)
2.2.13 PEBP家族成员基因全长及其ORF的获得
2.2.14 PEBP家族成员的生物信息学分析
2.2.15 PEBP家族成员启动子扩增
2.2.16 启动子生物信息学分析
2.2.17 质粒提取
2.2.18 PEBP家族成员在巴西橡胶树和转基因拟南芥中的表达分析
2.2.19 用于HbMFT1基因表达分析的样品采集
2.2.20 用于TFL1/CEN-like基因qRT-PCR的样品采集
2.2.21 用于FT-like基因qRT-PCR基因的样品采集
2.2.22 用于转化野生型拟南芥植物过表达载体的构建
2.2.23 用于转化拟南芥tfl1-1或者ft-10突变体植物过表达载体的构建
2.2.24 PEBP家族成员启动子与GUS基因重组植物表达载体的构建
2.2.25 根癌农杆菌GV3101(90RK)和GV3101(90)感受态细胞的制备
2.2.26 pXCS-PEBP质粒电击转化根癌农杆菌GV3101 (90RK)感受态细胞
2.2.27 pPEBP::GUS质粒电击转化根癌农杆菌GV3101 (90)感受态细胞
2.2.28 拟南芥的遗传转化
2.2.29 转基因拟南芥的筛选
2.2.30 转野生型拟南芥的Southern blot分析
2.2.31 转HbMFT1基因拟南芥表型分析
2.2.32 ABA对pHbMFT1::GUS转基因拟南芥的处理
2.2.33 GUS染色
3 结果与分析
3.1 橡胶树HBMFT1基因研究结果与分析
3.1.1 橡胶树HbMFT1的获得
3.1.2 橡胶树HbMFT1蛋白进化树分析
3.1.3 橡胶树HbMFT1表达分析
3.1.4 HbMFT1基因启动子克隆及启动子元件分析
3.1.5 橡胶树HbMFT1在不同光周期和温度条件下的表达模式
3.1.6 pHbMFT1::GUS在转基因拟南芥中的表达模式
3.1.7 在转基因拟南芥中ABA对pHbMFT1::GUS活性的影响
3.1.8 过表达35S::HbMFT1对转基因拟南芥种子萌发和小苗生长的影响
3.1.9 过表达35S::HbMFT1对转基因拟南芥开花的影响
3.1.10 HbMFT1基因过表达对转基因拟南芥生长发育相关基因表达的影响
3.2 橡胶树TFL1/CEN-LIKE基因研究结果与分析
3.2.1 TFL1/CEN-like基因的克隆与基因组结构分析
3.2.2 TFL1/CEN-like蛋白进化树分析
3.2.3 TFL1/CEN-like基因表达模式分析
3.2.4 TFL1/CEN-like基因一天中不同的表达模式分析
3.2.5 TFL1/CEN-like基因在野生型拟南芥中过表达延迟开花并改变表型
3.2.6 TFL1/CEN-like基因转化拟南芥tfl1-1突变体引起表型恢复
3.2.7 TFL1/CEN-like基因启动子顺式作用元件分析
3.2.8 TFL1/CEN-like基因启动子在转基因拟南芥中GUS活性分析
3.3 橡胶树FT-LIKE基因研究结果与分析
3.3.1 FT-like基因的克隆
3.3.2 FT-like蛋白同源性及进化树分析
3.3.3 橡胶树2个FT-like基因组织特异性表达分析
3.3.4 FT-like基因在不同季节的表达变化
3.3.5 不同光周期和温度对FT-like基因表达的影响
3.3.6 在野生型拟南芥中过表达35S::HbFT1和35S::HbFT2引起早花表型
3.3.7 过表达FT-like基因挽救拟南芥ft-10突变表型
3.3.8 FT-like基因启动子顺式作用元件分析
3.3.9 FT-like基因启动子在转基因拟南芥中GUS活性分析
4 讨论
4.1 关于橡胶树HBMFT1基因及其启动子的研究
4.2 关于橡胶树5个TFL1/CEN-LIKE基因及其启动子的研究
4.3 关于橡胶树2个FT-LIKE基因及其启动子的研究
5 结论
参考文献
ABBREVIATIONS
附图
附表
在读博士期间科研成果
致谢
本文编号：3748331
【文章页数】：154 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 自主调控途径
1.2 春化途径
1.3 光周期调控途径
1.4 GA调控途径
1.5 花成素
1.6 拟南芥FT基因表达调控
1.7 不同植物中FT同源基因的功能
1.8 PEBP家族
1.9 TFL1/CEN-LIKE基因
1.10 TFL1/CEN-LIKE基因调控开花机理
1.11 橡胶树概况
1.12 研究意义
1.13 本研究技术路线
2 实验材料与方法
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 实验所用的菌体及载体
2.1.3 实验器材
2.1.4 常用的试剂与药品
2.1.5 引物
2.2 实验方法
2.2.1 PEBP家族成员的获得
2.2.2 引物设计
2.2.3 巴西橡胶树RNA的提取
2.2.4 总RNA的消化及纯化
2.2.5 RNA纯度和质量检测
2.2.6 反转录
2.2.7 PEBP 3' UTR的获得
2.2.8 3'RACE产物胶回收
2.2.9 回收片段的TA连接
2.2.10 菌液PCR阳性检测和测序
2.2.11 PEBP家族成员5'UTR的获得
2.2.12 巴西橡胶树基因组DNA提取(用于大量提取)
2.2.13 PEBP家族成员基因全长及其ORF的获得
2.2.14 PEBP家族成员的生物信息学分析
2.2.15 PEBP家族成员启动子扩增
2.2.16 启动子生物信息学分析
2.2.17 质粒提取
2.2.18 PEBP家族成员在巴西橡胶树和转基因拟南芥中的表达分析
2.2.19 用于HbMFT1基因表达分析的样品采集
2.2.20 用于TFL1/CEN-like基因qRT-PCR的样品采集
2.2.21 用于FT-like基因qRT-PCR基因的样品采集
2.2.22 用于转化野生型拟南芥植物过表达载体的构建
2.2.23 用于转化拟南芥tfl1-1或者ft-10突变体植物过表达载体的构建
2.2.24 PEBP家族成员启动子与GUS基因重组植物表达载体的构建
2.2.25 根癌农杆菌GV3101(90RK)和GV3101(90)感受态细胞的制备
2.2.26 pXCS-PEBP质粒电击转化根癌农杆菌GV3101 (90RK)感受态细胞
2.2.27 pPEBP::GUS质粒电击转化根癌农杆菌GV3101 (90)感受态细胞
2.2.28 拟南芥的遗传转化
2.2.29 转基因拟南芥的筛选
2.2.30 转野生型拟南芥的Southern blot分析
2.2.31 转HbMFT1基因拟南芥表型分析
2.2.32 ABA对pHbMFT1::GUS转基因拟南芥的处理
2.2.33 GUS染色
3 结果与分析
3.1 橡胶树HBMFT1基因研究结果与分析
3.1.1 橡胶树HbMFT1的获得
3.1.2 橡胶树HbMFT1蛋白进化树分析
3.1.3 橡胶树HbMFT1表达分析
3.1.4 HbMFT1基因启动子克隆及启动子元件分析
3.1.5 橡胶树HbMFT1在不同光周期和温度条件下的表达模式
3.1.6 pHbMFT1::GUS在转基因拟南芥中的表达模式
3.1.7 在转基因拟南芥中ABA对pHbMFT1::GUS活性的影响
3.1.8 过表达35S::HbMFT1对转基因拟南芥种子萌发和小苗生长的影响
3.1.9 过表达35S::HbMFT1对转基因拟南芥开花的影响
3.1.10 HbMFT1基因过表达对转基因拟南芥生长发育相关基因表达的影响
3.2 橡胶树TFL1/CEN-LIKE基因研究结果与分析
3.2.1 TFL1/CEN-like基因的克隆与基因组结构分析
3.2.2 TFL1/CEN-like蛋白进化树分析
3.2.3 TFL1/CEN-like基因表达模式分析
3.2.4 TFL1/CEN-like基因一天中不同的表达模式分析
3.2.5 TFL1/CEN-like基因在野生型拟南芥中过表达延迟开花并改变表型
3.2.6 TFL1/CEN-like基因转化拟南芥tfl1-1突变体引起表型恢复
3.2.7 TFL1/CEN-like基因启动子顺式作用元件分析
3.2.8 TFL1/CEN-like基因启动子在转基因拟南芥中GUS活性分析
3.3 橡胶树FT-LIKE基因研究结果与分析
3.3.1 FT-like基因的克隆
3.3.2 FT-like蛋白同源性及进化树分析
3.3.3 橡胶树2个FT-like基因组织特异性表达分析
3.3.4 FT-like基因在不同季节的表达变化
3.3.5 不同光周期和温度对FT-like基因表达的影响
3.3.6 在野生型拟南芥中过表达35S::HbFT1和35S::HbFT2引起早花表型
3.3.7 过表达FT-like基因挽救拟南芥ft-10突变表型
3.3.8 FT-like基因启动子顺式作用元件分析
3.3.9 FT-like基因启动子在转基因拟南芥中GUS活性分析
4 讨论
4.1 关于橡胶树HBMFT1基因及其启动子的研究
4.2 关于橡胶树5个TFL1/CEN-LIKE基因及其启动子的研究
4.3 关于橡胶树2个FT-LIKE基因及其启动子的研究
5 结论
参考文献
ABBREVIATIONS
附图
附表
在读博士期间科研成果
致谢
本文编号：3748331
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