PagTAL参与杨树木质素合成与高温胁迫抗性的研究

发布时间：2023-04-09 22:32

　　转醛醇酶(Transaldolase,TAL)是磷酸戊糖途径(Pentose phosphate pathway,PPP)的关键酶,在拟南芥、水稻等相关研究中发现TAL基因对植物的维管形成、木质素合成以及植物抗逆具有一定的影响,但其在木本植物中的作用尚未报导。本文以84K杨为实验材料,通过PCR同源基因克隆法得到84K杨中的PagTAL1、PagTAL2基因,并对其进行生物信息学分析、组织特异性分析,结果显示PagTAL1、PagTAL2基因与毛果杨TAL基因同源性较高,其编码的蛋白均为亲水性蛋白,不含有分泌信号肽。亚细胞定位预测主要存在于叶绿体。本研究随后构建PagTAL-EGFP载体瞬时转化烟草,利用激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope,LSCM)进行亚细胞定位观察,结果显示PagTAL1和PagTAL2主要定位于叶绿体。之后,对PagTAL1、PagTAL2进行原核表达、酶活测定,结果显示该基因编码的蛋白具有转醛醇酶活性。为了进一步研究PagTAL1、PagTAL2在植株中的功能,本研究通过叶盘法转化得到过表达转基因材料。对8...

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 转醛醇酶的发现
    1.2 转醛醇酶的结构研究
    1.3 转醛醇酶基因的研究
    1.4 转醛醇酶参与的代谢途径及其作用
    1.5 植物转醛醇酶研究进展
        1.5.1 植物转醛醇酶来源与进化关系
        1.5.2 植物TAL的表达与分布
        1.5.3 植物转醛醇酶的生理功能
            1.5.3.1 应拉木与转醛醇酶
            1.5.3.2 转醛醇酶影响盐胁迫响应
            1.5.3.3 转醛醇酶影响维管的发育
    1.6 本论文的研究内容和意义
2 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 杨树材料
        2.1.2 烟草材料
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 菌株
        2.1.5 质粒
        2.1.6 溶液配制
            2.1.6.1 培养基的配制
            2.1.6.2 琼脂糖凝胶溶液配制
            2.1.6.3 基因组DNA提取液制备
            2.1.6.4 抗生素的配制
            2.1.6.5 试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 植物总RNA提取
        2.2.2 cDNA的合成
        2.2.3 植物基因组DNA的提取
        2.2.4 质粒小量提取
        2.2.5 普通琼脂糖凝胶DNA回收
        2.2.6 大肠杆菌感受态的制备
        2.2.7 大肠杆菌转化与阳性克隆鉴定
        2.2.8 农杆菌感受态的制备
        2.2.9 农杆菌转化与阳性克隆鉴定
        2.2.10 目的基因的克隆与载体构建
            2.2.10.1 基因克隆和纯化
            2.2.10.2 目的片段的扩增和测序
            2.2.10.3 酶切、连接与转化
            2.2.10.4 重组载体的鉴定
            2.2.10.5 CRISPR/Cas9靶点设计与载体构建
        2.2.11 烟草瞬时表达
        2.2.12 杨树稳定转化及转基因植株的筛选
            2.2.12.1 84K杨的叶盘法转化体系
            2.2.12.2 84K杨的愈伤组织再生体系
        2.2.13 荧光定量PCR检测
        2.2.14 原核蛋白的诱导表达及纯化
        2.2.15 蛋白浓度测定
        2.2.16 考马斯亮蓝考R-250染色法测定蛋白质含量
        2.2.17 转醛醇酶酶活测定
        2.2.18 植物超氧化物歧化酶(SOD)测定
        2.2.19 植物过氧化物酶(POD)测定
        2.2.20 植物丙二醛(MDA)测定
        2.2.21 激光共聚焦显微镜观察
        2.2.22 间苯三酚染色与观察
3 结果与分析
    3.1 杨树转醛醇酶基因的克隆及生物信息学分析
        3.1.1 PagTAL基因编码区序列(CDS)的克隆及分析
        3.1.2 84K中TAL蛋白的生物信息
        3.1.3 蛋白亲水性、疏水性、跨膜结构域与信号肽
        3.1.4 PagTAL与其他物种TAL的进化分析
    3.2 杨树转醛醇酶的原核表达及蛋白活性分析
        3.2.1 原核表达载体的构建、转化
        3.2.2 蛋白诱导表达和纯化
        3.2.3 原核表达蛋白酶活检测
    3.3 杨树转醛醇酶的过表达及功能分析
        3.3.1 植物过表达载体的构建
        3.3.2 PagTAL1、PagTAL2过表达植株的获得
        3.3.3 CRISPR/Cas9载体的转化
        3.3.4 过表达PagTAL植株的RNA转录水平检测
        3.3.5 PagTAL1过表达植株的酶活检测
    3.4 PagTAL1过表达对木质素合成的影响
    3.5 高温处理PagTAL1过表达植株的MDA及相关酶活性检测
4. 讨论
    4.1 杨树转醛醇酶基因的克隆及生物信息学分析
    4.2 杨树转醛醇酶基因的表达模式
    4.3 杨树转醛醇酶基因转基因株系的获得及研究
5. 结论
6. 参考文献
个人简介
导师简介
获得成果目录清单
致谢



本文编号：3787848