白桦BpGT14基因启动子的克隆及功能分析

发布时间：2023-06-01 18:19

　　本研究以白桦(Betula platypylla Suk.)为材料,运用改良的SiteFinding-PCR方法克隆得到了白桦BpGT14基因ATG上游2169 bp调控序列,并对其进行了元件分析。同时选取了其中含有启动子核心元件的1156 bp序列构建了 GUS及GFP植物瞬时表达载体,利用三亲杂交及农杆菌侵染的方法对启动子在烟草及白桦悬浮细胞中的启动模式进行了分析。利用酵母单杂交方法分别对启动子1156 bp片段及MYBPLANT元件进行了互作候选蛋白的筛选,并通过转录因子与启动子元件共转化烟草的方法对其互作进行了验证。主要研究结果如下:1、白桦BpGT14基因启动子的克隆及生物信息学分析启动子2169 bp序列分析结果表明,该启动子除含有转录必备的TATA box、CAAT box等元件外,还含有多种逆境及激素响应元件,其中包括31个脱水响应元件及23个低温响应元件及多个GA,ABA和生长素等激素响应元件。值得注意的是,该启动子含有两个苯丙烷及木质素生物合成途径的MYB类转录因子的重要结合元件。2、白桦BpGT14基因启动子活性分析对启动子转基因烟草植株进行GUS染色,结果表明该...

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 糖基转移酶简介
    1.2 糖基转移酶功能
        1.2.1 植物防御反应
        1.2.2 植物次生代谢产物修饰
        1.2.3 植物次生细胞壁合成
        1.2.4 植物激素平衡
    1.3 糖基转移酶14研究进展
    1.4 启动子研究
        1.4.1 启动子结构及功能
        1.4.2 启动子克隆方法
        1.4.3 启动子的应用
    1.5 转录因子研究
        1.5.1 转录因子简介
        1.5.2 转录因子分类及功能
    1.6 转录因子与启动子互作研究方法
        1.6.1 酵母单杂交(Yeast one Hybrid)
        1.6.2 免疫共沉淀(ChIP)
    1.7 研究意义
2 白桦BpGT14基因启动子的克隆及生物信息学分析
    2.1 实验材料
    2.2 实验方法
        2.2.1 白桦基因组DNA的提取
        2.2.2 白桦BpGT14启动子的克隆
        2.2.3 启动子生物信息学分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 白桦基因组DNA的提取
        2.3.2 白桦BpGT14基因启动子克隆
        2.3.3 白桦BpGT14基因启动子序列元件分析
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
3 启动子活性及非生物胁迫诱导响应分析
    3.1 实验材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 植物表达载体的构建
        3.2.2 植物表达载体农杆菌的转化
        3.2.3 BpGT14启动子在烟草中的表达活性
        3.2.4 启动子在白桦细胞中的表达活性
    3.3 结果与分析
        3.3.1 启动子pXGUS-P及pXGFP-P植物表达载体的构建及鉴定
        3.3.2 植物表达载体转化农杆菌的鉴定
        3.3.3 非生物胁迫下启动子在烟草中的表达活性
        3.3.4 启动子在白桦细胞中的表达活性
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
4 酵母单杂交筛选启动子片段结合候选蛋白
    4.1 实验材料
    4.2 实验方法
        4.2.1 启动子1156bp片段PCR扩增
        4.2.2 诱饵载体pAbAi线性化及与启动子片段的连接
        4.2.3 酵母感受态的制备
        4.2.4 重组诱饵载体pAbAi转化酵母感受态细胞
        4.2.5 诱饵酵母的鉴定
        4.2.6 报告基因在诱饵酵母中本底表达水平的测定
        4.2.7 白桦文库cDNA的合成
        4.2.8 酵母单杂交文库的构建及筛选
        4.2.9 阳性克隆菌株的鉴定
        4.2.10 阳性克隆cDNA插入片段的生物信息学分析
        4.2.11 启动子候选互作蛋白BpARF2基因的非生物胁迫响应
    4.3 结果与分析
        4.3.1 重组诱饵载体的构建
        4.3.2 重组诱饵质粒转化酵母感受态细胞
        4.3.3 报告基因在诱饵酵母中本底表达水平的测定
        4.3.4 白桦文库cDNA的合成
        4.3.5 酵母单杂交文库的构建及筛选
        4.3.6 阳性克隆cDNA插入片段的生物信息学分析
        4.3.7 启动子互作候选蛋白BpARF2基因非生物胁迫响应
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
5 酵母单杂交筛选启动子MYBPLANT元件结合候选蛋白
    5.1 实验材料
    5.2 实验方法
        5.2.1 MYBPLANT元件的构建
        5.2.2 诱饵载体pAbAi线性化及与双链DNA片段的连接
        5.2.3 酵母单杂交筛选MYBPLANT元件互作候选蛋白
    5.3 结果与分析
        5.3.1 MYB-pAbAi重组诱饵载体的构建
        5.3.2 MYBPLANT元件互作候选蛋白的筛选
    5.4 讨论
    5.5 本章小结
6 启动子MYBPLANT元件结合蛋白的鉴定
    6.1 实验材料
    6.2 实验方法
        6.2.1 候选蛋白互作强弱初步鉴定
        6.2.2 白桦BpAL4基因的克隆
        6.2.3 白桦BpAL4基因生物信息学分析
        6.2.4 候选蛋白互作强弱初步鉴定
        6.2.5 三次重复元件pCXGUS植物表达载体构建
        6.2.6 三亲杂交及农杆菌的遗传转化
        6.2.7 烟草中GUS基因表达水平鉴定
        6.2.8 非生物胁迫下白桦BpAL4基因表达水平鉴定
    6.3 结果与分析
        6.3.1 候选蛋白互作强弱鉴定
        6.3.2 白桦BpAL4基因的克隆
        6.3.3 白桦BpAL4基因生物信息学分析
        6.3.4 白桦BpAL4基因植物表达载体的构建
        6.3.5 三次重复元件pCXGUS植物表达载体构建
        6.3.6 BpAL4蛋白及MYBPLANT元件共转化分析
    6.4 讨论
    6.5 本章小结
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢



本文编号：3826787