松材线虫dauer形成相关基因akt-1和daf/-8表达调控研究

发布时间：2023-06-04 20:44

　　松材线虫在环境不利条件下形成dauer型幼虫,这种dauer型幼虫能够感受传媒昆虫——松墨天牛蛹的存在,向其蛹室聚集并附着在天牛体内,当松墨天牛蛹羽化为成虫之后,松材线虫便借助天牛的飞行移动实现寄主转移,从而引起病害的传播和流行。目前,科学界对松材线虫dauer型幼虫的形成机制尚不清楚,这也为阻止松材线虫dauer型幼虫形成和切断病害流行等特异性的防控技术设置了障碍。因此,本文选择了两个与松材线虫dauer型幼虫形成相关的基因akt-1和daf-8,采用实时定量PCR(q PCR)、原位杂交(in situ hybridization)和显微注射(microinjection)等现代分子技术,系统研究其时空表达特性,并采用RNA干扰(RNAi)技术研究这两个基因在松材线虫dauer型幼虫形成过程中的调控功能,以期为揭示松材线虫Dauer型幼虫的形成机理提供基础。具体研究结果如下:1.q PCR分析结果显示,akt-1和daf-8基因的表达变化具有高度的一致性,即从胚胎到L2表达量显著增加,L2时的表达量最高,随后逐步下降。这表明akt-1和daf-8基因可能在松材线虫dauer形成之前...

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
引言
1 文献综述
    1.1 松材线虫病及松材线虫基础生物学研究进展
    1.2 线虫dauer型幼虫形成机制研究进展
        1.2.1 松材线虫dauer型幼虫形成机制研究进展
        1.2.2 其它线虫dauer型幼虫形成机制研究进展
    1.3 dauer型幼虫形成相关基因akt-1研究进展
    1.4 dauer型幼虫形成相关基因daf-8研究进展
    1.5 研究的目的和意义
2 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 供试线虫的培养与收集
        2.1.2 供试菌株与质粒
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器设备
        2.1.5 所用培养基
        2.1.6 所需溶液配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 繁殖周期的不同发育时期的同步松材线虫的获得
            2.2.1.1 松材线虫同步胚胎的获得
            2.2.1.2 各发育时期的同步松材线虫的获得
        2.2.2 松材线虫akt-1和daf-8基因的克隆
            2.2.2.1 松材线虫总RNA的提取与检测
            2.2.2.2 松材线虫总RNA反转录
            2.2.2.3 PCR扩增目的基因
            2.2.2.4 目的片段回收
            2.2.2.5 重组质粒的构建
            2.2.2.6 重组质粒导入大肠杆菌
            2.2.2.7 重组子的筛选
            2.2.2.8 质粒提取
        2.2.3 松材线虫akt-1和daf-8基因不同龄期实时定量PCR(qPCR)分析
            2.2.3.1 松材线虫qPCR模板的制备
            2.2.3.2 不同龄期松材线虫akt-1、daf-8基因的qPCR分析
        2.2.4 松材线虫akt-1和daf-8基因原位杂交实验（in situ hybridization）
            2.2.4.1 原位杂交探针的制备
            2.2.4.2 松材线虫的固定
            2.2.4.3 杂交与检测
        2.2.5 松材线虫akt-1和daf-8基因在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达
            2.2.5.1 松材线虫akt-1和daf-8基因启动子表达载体构建
            2.2.5.2 松材线虫akt-1和daf-8基因启动子表达载体的显微注射
        2.2.6 松材线虫akt-1和daf-8基因RNA干扰（RNAi）实验
            2.2.6.1 akt-1和daf-8基因含T7启动子干扰片段的获得
            2.2.6.2 dsRNA的制备
            2.2.6.3 RNAi浸泡实验
3 结果与分析
    3.1 松材线虫akt-1和daf-8基因克隆
        3.1.1 松材线虫总RNA提取
        3.1.2 PCR扩增松材线虫akt-1和daf-8基因
        3.1.3 重组子筛选
    3.2 松材线虫akt-1和daf-8基因的表达研究
        3.2.1 松材线虫akt-1和daf-8基因实时定量PCR
            3.2.1.1 松材线虫不同龄期同步线虫总RNA提取
            3.2.1.2 实时定量PCR引物设计
            3.2.1.3 松材线虫akt-1和daf-8基因不同发育时期qPCR分析
        3.2.2 松材线虫akt-1和daf-8基因In situ hybridization
            3.2.2.1 松材线虫akt-1和daf-8基因克隆
            3.2.2.2 PCR扩增含SP6及T7启动子的目的片段
            3.2.2.3 松材线虫akt-1和daf-8基因原位杂交实验
        3.2.3 松材线虫akt-1和daf-8基因在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达
            3.2.3.1 松材线虫akt-1和daf-8基因的转基因表达载体构建图
            3.2.3.2 PCR扩增载体片段
            3.2.3.3 PCR扩增松材线虫akt-1和daf-8基因启动子区域
            3.2.3.4 In-fusion Cloning
            3.2.3.5 秀丽隐杆线虫转基因F2代荧光观察
    3.3 松材线虫akt-1和daf-8基因RNA干扰实验
        3.3.1 PCR扩增akt-1和daf-8基因含T7启动子干扰片段
        3.3.2 RNAi浸泡实验
            3.3.2.1 同步卵11 h、卵18 h RNAi浸泡实验
            3.3.2.2 同步L2幼虫RNAi浸泡实验
4 讨论
5 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
个人简介
致谢



本文编号：3830985