欧美杨细菌性溃疡病菌双组分基因LqHK1和LqRR2的功能研究

发布时间：2024-06-08 04:46

　　由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的欧美杨溃疡病是一种新发现的毁灭性林木病害,该病主要危害欧美杨,如中林46杨(Populus× euramericana cv.’Zhonglin 46’)、107杨(P:× euramericana cv.’74/76’)等品种,造成发病枝条死亡、顶梢干枯死亡,严重影响杨树健康和木材生产,尚未有效的防治措施。开展该病菌的致病性机制研究将有助于制定有效的防控技术和开发新型药剂靶标位点。本文主要通过研究双组分系统信号基因在病原菌致病机制和生物学过程的功能,明确双组分系统组氨酸蛋白质激酶LqHK1和反应调节因子LqRR2的生物学和致病性作用机理,主要研究结果如下:通过对LqHK1序列进行生物信息学分析,然后根据同源重组的原理,构建自杀质粒pWM91-△LqHK1,获得了 LqHK1缺失突变体。结果显示欧美杨细菌性溃疡病菌N-5-1基因组中,LqHK1为单拷贝,编码区长1350 bp,编码450个氨基酸。致病力测试表明:LqHK1基因的缺失突变体在107杨杨树枝干上的致病力显著降低,HBLqLqHK1菌株恢复至野生型状态;通...

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 文献综述
    1.1 细菌双组分信号转导系统简介
    1.2 细菌双组分信号转导系统的组成
        1.2.1 组氨酸激酶
        1.2.2 反应调节蛋白
    1.3 原核和真核生物中,双组分系统的比较
    1.4 双组分信号转导系统的类型和转导模式
        1.4.1 简单双组分系统的组氨酸残基到天冬氨酸残基的磷酸化
        1.4.2 复杂双组分系统的多个His-to-Asp磷酸化转移
    1.5 不同双组分信号转导系统的信号交流(cross-talk)
    1.6 双组分信号转导系统的特点
        1.6.1 多样性
        1.6.2 复杂性
    1.7 双组分信号转导系统与病原菌的致病力相关
    1.8 欧美杨细菌性溃疡病的研究进展
        1.8.1 病原及致病性危害
        1.8.2 欧美杨细菌性溃疡病病菌侵染循环
        1.8.3 欧美杨细菌性溃疡病病菌检测方法和技术
        1.8.4 病原菌的Ⅲ型分泌系统
    1.9 研究目的和意义
2. LqHK1基因的功能研究
    2.1 实验材料及方法
        2.1.1 菌种、质粒及引物
        2.1.2 试剂
        2.1.3 供试植物
        2.1.4 培养基
        2.1.5 菌株的保存、活化及培养
        2.1.6 试剂及抗生素浓度
        2.1.7 DNA提取
        2.1.8 PCR片段扩增、回收
        2.1.9 酶切及连接
        2.1.10 质粒热击转化
        2.1.11 两亲结合方法
        2.1.12 三亲结合方法
        2.1.13 Southern杂交验证突变体
        2.1.14 RNA的提取、纯化与反转录
        2.1.15 Real-time PCR
        2.1.16 L.quercina LqHK1敲除突变体的构建
        2.1.17 L.quercina LqHK1基因敲除突变体的获得
        2.1.18 LqHK1基因互补突变体的构建
        2.1.19 生长曲线测定
        2.1.20 游动能力的测定
        2.1.21 生物膜形成能力测定
        2.1.22 致病性反应测试
        2.1.23 荧光定量PCR检测发病部位病原菌含量
        2.1.24 游动性相关基因表达量分析
        2.1.25 胞外多糖测定
        2.1.26 过氧化氢敏感性检测
        2.1.27 纤维素酶活性检测
    2.2 结果与分析
        2.2.1 LqHK1基因上下同源臂的扩增
        2.2.2 重叠PCR融合同源臂
        2.2.3 自杀载体的构建
        2.2.4 突变体的构建分析
        2.2.5 LqHK1基因互补突变体的获得与验证
        2.2.6 LqHK1缺失突变体生长速率未受影响
        2.2.7 LqHK1基因缺失对生物膜的影响
        2.2.8 LqHK1缺失影响病原菌游动性及相关基因的表达
        2.2.9 LqHK1基因突变体导致致病性下降
        2.2.10 突变体影响病原菌在寄主植物上的定殖能力
        2.2.11 突变体胞外多糖测定
        2.2.12 过氧化氢敏感性测定
        2.2.13 纤维素酶检测
    2.3 小结与讨论
3 LqRR2的功能分析
    3.1 实验材料及方法
        3.1.1 菌种、质粒及引物
        3.1.2 试剂
        3.1.3 生物信息学分析方法
        3.1.4 接种植物
        3.1.5 LqRR2基因敲除突体的构建
        3.1.6 LqRR2基因缺失突变体的获得
        3.1.7 LqRR2基因互补突变体的构建
        3.1.8 生长曲线、游动性、生物膜测定
        3.1.9 胞外多糖检测
        3.1.10 致病性反应测试
        3.1.11 荧光定量PCR检测发病部位病原菌含量
        3.1.12 游动性相关基因表达量分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 LqRR2基因上下同源臂的扩增
        3.2.2 重叠PCR融合同源臂
        3.2.3 自杀载体的构建
        3.2.4 LqRR2基因缺失突变体的验证
        3.2.5 LqRR2基因互补突变体的验证
        3.2.6 双组分系统孤对蛋白LqRR2的结构分析
        3.2.7 LqRR2缺失突变体生长速率未受影响
        3.2.8 LqRR2基因缺失未影响生物膜的形成
        3.2.9 LqRR2基因缺失未影响胞外多糖的形成能力
        3.2.10 LqRR2基因突变影响游动性及相关基因的表达
        3.2.11 突变体导致致病性下降
        3.2.12 突变体影响病原菌在寄主植物上的定殖能力
        3.2.13 纤维素酶检测
    3.3 小结与讨论:
4 全文结论与讨论
参考文献
个人简介
导师简介
致谢



本文编号：3991476