巴西橡胶树低磷胁迫应答相关E3泛素连接酶互作蛋白的筛选研究

发布时间：2025-01-17 20:19

　　蛋白泛素化修饰是一种在真核生物多种生理过程中发挥重要作用的翻译后修饰形式,是靠E3泛素连接酶对关键基因的精确识别来实现其功能的多样性和特异性。研究表明,在植物低磷胁迫应答相关的根系形态建成、磷吸收转运以及激素代谢等过程中蛋白泛素化修饰都发挥了非常重要的调控作用。本研究以橡胶树组培苗为材料构建了地上部地下部均一化酵母双杂交cDNA文库,以前期通过抑制差减杂交(SSH)获得的2个低磷胁迫应答相关的E3泛素连接酶基因HbSIN4T2、HbTIR1构建诱饵载体,并通过酵母双杂交技术分别筛选了互作蛋白。继而克隆获得互作蛋白的cDNA全长,并通过生物信息学对互作蛋白进行了分析,以期探索这些E3泛素连接酶基因在橡胶树低磷胁迫应答中的调控作用。主要的研究成果如下:1.构建了橡胶树地上部均一化cDNA文库,文库滴度8×107cfu/mL,所得文库插入片段≥0.5 kb的重组率为100%;2.构建了橡胶树地下部均一化cDNA文库,文库滴度7×107cfu/mL,所得文库插入片段≥0.5 kb的重组率为87%;3.构建了两个与低磷胁迫应答相关的E3泛素连接酶诱饵载体HbSIN4T2、HbTIR1;4.利用酵母...

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１橡胶树地上部（Ａ）和地下部（Ｂ）总ＲＮＡ??

胶树低磷胁迫相关Ｅ３泛素连接酶底物的筛３结果与分析??部地下部均一化酵母双杂交ｃＤＮＡ和地下部总ＲＮＡ的提取??续实验要求的ｍＲＮＡ，总ＲＮＡ的质ＣＴＡＢ法（淦国英等，２００９；郭秀莲等，ＲＮＡ。然后通过１．２％琼脂糖凝胶电泳ｒＲＮＡ和２８ＳｒＲＮＡ条带清楚（图丨），ＲＮＡ没有降....

图２地上部（Ａ）地下部（Ｂ）均一化之后（１）和均一化之前（２）的ｃＤＩＮＡ检测结果??Ｎｋｅｒ

３．１．３?ｄｓ－ｃＤＮＡ的合成及ＤＳ＿—化效果??以３．０ｐＬｍＲＮＡ反转录合成第一链，然后经两轮ＬＤ－ＰＣＲ扩增后，电泳检测结??果显示ｄｓ－ｃＤＮＡ呈弥散状，片段分布较广，且丰度各异（图２）。由此表明，大小??不一和丰度各异的ｍＲＮＡ都得到了预期的反转录和扩增。??ｄｓ－ｃ....

图３地上部（１和２）和地下部（３和４）均一化前后１８ＳｒＲＮＡ表达丰度变化检测??＿

用管家基因１８Ｓ?ｒＲＮＡ分别对地上部和地下部ＤＳＮ均一化前以及均一化并过柱纯化??后的ｃＤＮＡ进行扩增检测。经扩增３０个循环后，ＤＳＮ均一化处理后的ｃＤＮＡ中，??１８ＳｒＲＮＡ基因的表达丰度均明显低于均一化之前（图３）。以上结果表明，均一化??处理有效地降低了高丰度基因，过柱....

图５地下部均一化文库的菌落生长情况??－

３．１．４均一化酵母双杂交文库构建及质量评价??过柱纯化后的ｄｓ－ｃＤＮＡ和线性化质粒ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ共转化Ｙ１８７感受态细胞，??转化后的菌落生长情况如图４和图５所示。经统计和计算，初始文库独立克隆地上??部为２．２８ｘｌ〇６ｃｆｕ，地下部为２．０４ｘｌ〇６ｃｆｕ，取收集后....

本文编号：4028453