丁酸梭菌的分离及其预发酵对产沼气的影响研究

发布时间：2020-04-26 17:33

【摘要】：沼气是一种可再生的清洁能源，在我国北方地区，由于冬季漫长寒冷，沼气的生产存在发酵过程中过度酸化和产气率低等问题。针对这一现象，本文运用传统微生物学、现代分子生态学和生物学技术手段，从新鲜沼液中分离纯化出一株产丁酸的梭菌芽孢杆菌（Clostridium），并将其扩大培养后转接至厌氧发酵体系使之成为优势菌群，通过丁酸梭菌预发酵处理，将水解发酵阶段的产物控制为以丁酸为主的混合物，进而达到提高体系产沼气速率和产沼气量的目的。（1）通过亨盖特厌氧操作技术，将沼液中的微生物富集培养，特异性地分离、筛选出1株梭状芽孢杆菌，并进一步进行验证实验，包括碳源实验、吲哚反应、明胶液化和淀粉水解等生理生化实验以及16S rDNA序列分析鉴定其为丁酸梭状芽孢杆菌。（2）通过单因素实验，研究了初始pH值、发酵时间、培养温度、接种量、碳源和氮源对丁酸梭菌扩大培养的影响。优化出最佳条件为：初始pH值为8.0，培养温度为37.0℃，接种量为5.0%。发酵培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，碳酸氢氨10g/L，葡萄糖10g/L，盐溶液40ml，半胱氨酸0.5g/L，刃天青0.5ml/L(0.1%)，配置过程中严格厌氧。（3）建立并优化实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）方法，监测沼气发酵过程中丁酸梭菌的动态变化规律。以定量的10倍梯度稀释的标准品为模板进行扩增和标准曲线的建立。结果显示各浓度标准品的扩增曲线间呈现良好的梯度分布，标准曲线的Ct值和起始模板拷贝数在1.9×101~1.9×106。拷贝间具有良好的线性关系，线性回归方程函数表达式为Y=－3.56X+57.55（代表起始模板拷贝数的对数，Y代表Ct值），且Ct值与起始模板的拷贝数的相关性为0.997。通过动态监测分析，体系内丁酸梭菌数量动态变化规律与丁酸产量的变化趋势相吻合。（4）以猪粪为发酵基质，用丁酸梭菌对猪粪进行预发酵，，提高沼气发酵产酸阶段的丁酸含量，降低丙酸含量。采用Plackett-Burman（P-B）试验确定丁酸发酵过程中的显著因素，采用中心组合试验设计（CCD）优化丁酸预发酵条件。结果表明最佳的发酵条件为：含水率、培养时间和温度分别为62.04%、27.22h和37.13℃。在优化出的最佳的条件下，丁酸的实际发酵产量达到21.13g/kg，利用数学模型模拟得知最佳丁酸产量为21.55g/kg，说明利用响应曲面法优化猪粪的丁酸预发酵是有效的。（5）以优化后的丁酸预发酵条件进行沼气发酵，其沼气产量比未经预发酵的对照相比，沼气产气量提高19.02%。
【图文】：

标准曲线,标准曲线,标准样品,线性方程

Y 为响应值；Xi，Xj 为变量；β0,βi,βii,βij 分别为常方项系数、交互作用项系数。 STATISTICA 10.0 对实验数据进行变量分析（ANOVA）和多项式方程绘制出响应曲面图和等高线图，以期得出最佳果与讨论发酸标准样品的标准曲线酸、丙酸、丁酸（色谱级）标准样品按梯度稀释，如 5.1.件下进样，以进样浓度为横坐标，以峰面积值为纵坐标，得如图 5-1（a、b、c）所示，乙酸的线性方程为 Y=13509x+5 Y=13130x+4183.1，丁酸的线性方程为 Y=12807x+4507。01 1 1n n ni i ii i ij i ji i i jY X X X Y
【学位授予单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S216.4

【参考文献】