烟草根际促生菌Sm-1的分离及其外泌铁载体的纯化与鉴定

发布时间：2020-05-10 11:47

【摘要】：烟草根际生活着种类繁多的微生物,这些微生物对于改变土壤肥力水平和营养结构起到了至关重要的作用,其中的有益微生物与烟草之间经过长期的协同进化,形成了许多生理机制,来促进彼此的生长发育。本研究从烟草K326根际分离筛能分泌铁载体的促生菌株Sm-1,16S rDNA鉴定结果表明,该菌株为草螺菌属细菌(Herbaspirillum spp.);随后通过高效液相色谱法分离和纯化了sm-1分泌的铁载体,并通过质谱和核磁波谱法对其进行了表征。为了获得更高产量的铁载体,本论文还通过Plackett-Burman法优化了Sm-1产铁载体的发酵条件。本论文的主要研究结果如下:1.采用稀释涂布平板法从烟草K326根际分离得到6株外观形态有显著性差异的促生菌,根据CAS蓝色平板检测法筛选出分泌铁载体能力最强的菌株Sm-1,并通过16S rDNA鉴定得出Sm-1菌株与草螺菌(Herbaspirillum spp.)的16S rDNA序列相似度达到99%。2.采用SM低铁培养基,通过中试发酵获得了Sm-1的50 L发酵液。基于高效液相色谱法分离和纯化Sm-1分泌的铁载体,编号分别为Sm-1-1-2-1、Sm-1-1-2-2和Sm-1-1-3-1,纯度达到98%以上。采用质谱法和核磁共振波谱法对纯化得到的3个物质进行表征分析,结果表明:Sm-1-1-2-1、Sm-1-1-2-2和Sm-1-1-3-1的分子量分别为162.0461、444.1596和444.1592。3.以SM培养基为对照,采用Plackett-Burman优化法对Sm-1菌株设计了17因素,N=20的实验设计,对影响Sm-1菌株铁载体分泌量的主要因素进行筛选,结果表明:钙离子和硫酸根离子对Sm-1菌株铁载体分泌量的影响最显著,维生素B_1是最主要的诱导因子,C源和N源的对Sm-1菌株铁载体的分泌量无明显影响,其他因素影响不显著,优化后的Sm-1菌株发酵培养基成分为硫酸钙0.3 g,维生素B_1 1.5 g,天冬氨酸1.5g,磷酸氢二钾3.0 g,琥珀酸1.5 g,硫酸镁0.3 g,超纯水1 L。优化后的培养基培养Sm-1菌株后的发酵液在CAS蓝色平板上形成的橙黄色晕圈(3.6 cm)明显大于SM培养基(3.0 cm),说明优化后的培养基培养Sm-1菌株能使其产生更多铁载体。总体来说,Sm-1菌株具有很强的分泌铁载体的能力,经16S rDNA鉴定其为草螺菌属细菌(Herbaspirillum spp.)。缺铁培养基能诱导Sm-1菌株分泌铁载体,通过优化发酵培养基成分能使Sm-1菌株在低成本的前提下分泌尽可能多的铁载体,提高产量。采用高效液相色谱法可以对Sm-1菌株分泌的铁载体进行分离纯化,从而得到纯的铁载体单体,有利于今后研究铁载体与植物相互作用机理,铁载体对重金属的螯合机制。本论文的研究成果可为烟草根际促生菌外泌铁载体在促进烟草生长和植烟土壤重金属污染的生物防治等方面的研究提供理论基础与技术支撑,在提高烟草产质量和保护土壤生态安全等方面具有广泛的应用价值。
【图文】：

性[45]。铁载体的另一个重要作用是矿物风化，从而有利于大量营养元中，如P, Ca和N等，改善植物和微生物的矿质营养[46, 47]。铁载体缓解ACC脱氨酶的合成，从而降低植物根围ACC水平，，并将ACC转移到土A是植物和微生物产生的一种生长激素，研究表明重金属胁迫能极大氧化降解，从而抑制植物的生长。有报道称Cd和Cu处理的豌豆苗中化，而铁载体的存在能降低这一过程[49, 50]。而铁载体在Al3+, Cd2+, Cu2金属离子的降解中陆续被报道，土壤微生物及其分泌的铁载体与植物互作用如图 1-1 所示。

2.3.1 烟草根际促生菌的分离结果通过稀释涂布平板法分离 K326烟草根际的促生菌，涂布在 LB 平板上，30 ℃恒温培养箱倒置培养48 h 后，观察细菌生长情况，如图2-1。仔细观察对比不同菌落的形态、大小、颜色和表面光滑程度等，发现总共有6种外观典型不同的菌落。图 2-1 烟草 K326 根际产铁载体促生菌的分离Fig.2-1 The separation of K326 tobacco rhizosphere endophytic bacteria secreting siderophore对分离得到的6种菌落分别划线纯化，每一种菌落随机挑取3个单菌落在 LB 平板上划线（如图2-2）。挑取单菌落接种至 LB 液体培养基中培养10 h，然后与体积浓度为50%的无菌甘油混合于2 mL PE 管，密封，-80 ℃保存，并进行编号。图 2-2 烟株 K326 根际促生菌的纯化Fig.2-2 The purification of K326 tobacco rhizosphere endophytic bacteria
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S572;S154.3

【参考文献】

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本文编号：2657249