印度谷螟对Bt毒素的抗性机制研究

发布时间：2020-05-21 06:58

【摘要】：印度谷螟Plodia interpnct(Hübner)是世界性的储粮害虫,我国大部分地区都有其危害报道。本试验综合运用生物化学、分子生物学等学科知识,着眼于储粮害虫对转Bt基因稻谷产生抗性这一现实问题,以印度谷螟为研究对象,借助Illumina测序法、酶活力测定法、RT-PCR、RNA干扰等最新技术,研究印度谷螟中与Bt毒素关系密切的中肠保护酶及中肠可能的Bt毒素受体—氨肽酶N和钙黏蛋白基因,为深入了解转Bt基因稻谷的杀虫机理奠定基础。结果如下:1.对印度谷螟敏感品系和Bt毒素胁迫品系进行转录组测序,序列经过De novo 组装得到 37246 个 Unigene,分别有 22211 个,14161 个,17755 个,15750个,9348 个,10694 个 Unigene 注释到 NR,NT,Swiss-Prot,KEGG,COG,GO数据库,共23310个Unigene获得注释。Nr数据库比对中发现印度谷螟有67.6%的基因序列比对上帝王蝶。为了进一步研究印度谷螟对Bt毒素的抗性机理,我们对两种品系中表达量有显著差异的基因进行了分析,34466条基因中有15741条在胁迫品系中表达量上升,18725条下降,而差异极其显著的基因共有10224条。其中,有9、55、10和4条基因分别编码APN,Cadherin,ALP和Glycolipid。其中编码APN的基因在胁迫品系中都显著上升,而其他3个受体基因在2个品系中并没有明显差别。这说明APN基因参与到了印度谷螟对Bt毒素的抗性机制中。2.微小RNA(miRNA)是参与基因调控的1组小RNA,受到越来越多的重视,然而对于印度谷螟中调节基因表达的miRNA研究很少。本研究构建了印度谷螟卵、幼虫、蛹和成虫共12个小RNA转录组文库(每个虫态3个重复)并进行高通量测序分析。最终,我们获得了 173.2百万个原始数据,并确定了 1906已知的miRNA和588个新的miRNA。大多miRNA在每个虫态中具有特异性。使用GO和KEGG对miRNA的靶基因进行鉴定和注释,并对二者的表达趋势进行分析。结果表明miRNA对印度谷螟的生长发育起到了重要的调节作用,有助于从新的角度进行印度谷螟防治技术开发。3.研究了取食转Bt水稻后印度谷螟幼虫体内3种保护酶SOD(superoxide dismutase)、POD(peroxidase)和 CAT(catalase)活性的变化。结果表明,用转Bt基因水稻短时饲喂印度谷螟后,其幼虫体内SOD活力开始呈上升状态,但是随着取食时间的延长而缓慢下降,印度谷螟幼虫取食不同浓度的转Bt基因水稻12d和5个月后,其体内的SOD活力受到了显著抑制,在取食100mg/g转Bt基因水稻5个月后,其SOD活力与对照相比下降了 38.75%,差异显著(P0.01)。印度谷螟幼虫在取食100mg/g转Bt基因水稻72h内,其体内POD活性始终低于对照组,但是在取食不同浓度的转Bt基因水稻12d和5个月后,其POD活性与对照相比显著增加了(P0.01)。印度谷螟幼虫体内的CAT活力在其取食转Bt基因稻谷48h后开始高于对照组,并且在12d和5个月的试验中,其CAT活力随着Bt毒素含量的增加而持续升高。结果说明Bt短时处理后,印度谷螟幼虫体内3种保护酶的增降趋势各不相同,3种酶的平衡关系被打破了,导致细胞内自由基水平过高,毒素对害虫的毒杀作用便发挥了。然而长期暴露于转Bt基因水稻的印度谷螟幼虫,其抵抗Bt胁迫的能力增强,形成了较为完善的防御系统。4.利用RT-PCR结合RACE技术,克隆得到2个氨肽酶N(PiAPN1和PiAPN2)和1个钙粘蛋白(PiCad)的基因全长序列。它们的开放阅读框分别为2847bp,2844bp和5199bp,编码948、947和1732个氨基酸。每个蛋白质序列的分子量分别为116.92、114.07和205.45kDa。计算出的等电点分别为4.78、4.90和4.18。PiAPN1、PiAPN2和PiCad都含有1个信号肽和不同数目的CR结构域。构建系统发育树,发现PiAPN2的氨基酸序列与HaAPN具有最大的相似性(70%),而PiAPN1与其他基因具有相对较低的序列同源性。至于PiCad,其氨基酸序列与其他鳞翅目物种的已知钙粘蛋白基因序列具有较高的相似性。5.通过qRT-PCR测定不同发育阶段和Bt毒素诱导下的PiAPN1、PiAPN2和PiCad三种靶基因的表达水平。结果表明,3个靶基因在幼虫中的表达量显著高于其他虫态,同时Bt毒素的诱导对3个靶基因的表达水平具有显著的影响。为了进一步探究3个基因与Bt毒素的关系,通过RNA干扰(RNAi)技术分别沉默3个目标基因,并测定特定基因沉默后昆虫对Bt毒素的敏感性变化,结果表明,微量注射法成功干扰3个目标基因,造成基因表达量显著下调。3个基因表达量下调造成印度谷螟对Cry1Ab毒素的敏感性显著下降(P0.05)。证明PiAPN1、PiAPN2和PiCad基因与印度谷螟对Cry1Ab的抗性机制密切相关。
【图文】：

物种分布,物种分布,同源性

械模胖捣植迹嚅颐强梢钥吹剑玻埃醶担サ淖⑹托蛄校]3?Ｅ值小于１．０Ｅ－１００，邋１５．５％注释序列Ｅ值范围在１．０Ｅ－１００到１．０Ｅ－６０之间，二者逡逑之间具有强同源性（图２．２）。序列相似性分布表明，２６．１邋％的序列有８０％甚至逡逑更高的同源性，而７３．９％的序列同源性在１７％－８０％之间。至于物种，与本试虫逡逑相似度最高的是美国帝王蝶（Ａｍｅｒｉｃａｎ邋ｍｏｎａｒｃｈ，邋６７．６０％），其次是家香（■Ｂｏｍｆｔｙｘ逡逑ｍｗ＾，６．５％）、赤拟谷盗（７ｈ＇》ｏ＂ｗｗｃａｙｔｏ７ｅｗｗ，３．４％）等（图邋２．２）。逡逑表２．３注释结果统计逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．３邋Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ逡逑Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋Ｆｉｌｅ邋ＮＲ邋ＮＴ逦Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ逦ＫＥＧＧ逦ＣＯＧ邋ＧＯ邋ＡＬＬ逡逑Ａｌｌ－Ｕｎｉｇｅｎｅ逦２２，２１１逦１４，，１６１逦１７，７５５逦１５，７５０逦９３４８逦１０，６９４逦２３，３１０逡逑■邋Ａｍｅｒｉｃａｎ邋ｍｏｎａｒｃｈ逡逑２－

印度谷螟对Bt毒素的抗性机制研究

图２．４邋ＣＯ?
【学位授予单位】：南京财经大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S379.5

【参考文献】