Vacht,aldh 3b1和gusb参与latrophilin对赤拟谷盗杀虫剂抵抗性的调控及其生理功能研究

发布时间：2020-07-07 02:42

【摘要】：Latrophlin(lph)是蛛毒素受体,先前的研究显示其具有药物敏感性。lph下游基因囊泡转运蛋白(vacht)、乙醛脱氢酶3家族B1成员(aldh3b1)和葡萄糖醛酸酶(gusb)广泛存在昆虫中,并且vacht其功能涉及神经递质胞内转运、可作为药物开发靶点。Aldh3b1功能涉及乙醇代谢和解毒代谢。Gusb其功能涉及哺乳动物体内的异源物质代谢和化学农药降解。但在昆虫中关于这三个基因本身生物学功能、与昆虫杀虫剂敏感性的关系和如何参与lph下游功能调控等暂时都还未有相关阐述。因此,研究vacht、aldh3b1和gusb的功能不仅能揭示这三个基因的本身功能也为昆虫对杀虫剂抗性机制的研究提供理论依据,还能为lph下游解毒信号通路阐述奠定基础。本文通过实时荧光定量PCR鉴定了 lph下游vacht、aldh3b1和gusb三个基因在lph敲除后的表达量,发现vacht、aldh3b1和gusb在lph缺失后都显著下调表达。为了探究lph调控下游这三个基因药物应激过程。我们选取这三个显著下调表达的基因进一步探究他们在药物敌敌畏和克百威处理下7个时间点的表达模式。结果显示,敌敌畏和克百威处理后都会诱导vacht、aldh3b1和gusb上调表达,表明lph下游的这三个基因都能参与药物应答。但这三个基因的对药物应达模式不一致,暗示这三个基因在参与药物应答方面有自己的单独机制。并且干扰这三个基因后用半致死浓度药物处理,比起对照组,干扰组幼虫死亡率明显上升,表明vacht、aldh3b1和gusb具有药物敏感性和杀虫剂抗性。为了探究这三个基因如何参与lph下游杀虫剂抵抗性,我们用半致死浓度药物处理抑制lph表达的幼虫,后定量ds-lph组中vacht、aldh3bl和gusb表达量,结果显示vacht上调表达,aldh3b1和gusb下调表达。暗示虽然这三个基因都在lph下游,但vacht仅在lph通路中起作用,aldh3b1和gusb在lph缺失后还能上调表达,表明aldh3b1和gusb可能还在别的信号通路中参与调控杀虫剂抵抗性,该通路很可能对lph起补偿作用。我们对vacht、aldh3b1和gusb做进一步生理功能分析。首先,这三个基因的时空表达模式分析显示他们在不同的发育时期和组织中都可表达。对幼虫期vacht干扰导致产卵量下降30%,所有后代都不能孵化且ACh和vg表达量与对照组相比发生降低。表明vacht降低后通过降低ACh含量进一步阻碍昆虫羽化和生殖。且vacht降低会影响营养信号通路中乙酰辅酶A的胞外摄取,进而影响VG合成,进而影响生殖。aldh3b1和gusb干扰后对生长发育没有影响但vg表达量与对照组相比发生降低。猜测有其它生殖信号通路参与调控aldh3bl和gusb对生殖的影响来恢复二者降低对生殖的影响。总之,本文鉴定了lph下游基因vacht、aldh3b1和gusb本身杀虫剂抵抗性和生理功能,还为lph信号通路的鉴定提供了基础。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S379.5
【图文】：

图２．４．１／ｐ／；下游基因ＲＮＡ－ｓｅｑ数据验证逡逑注：ＷＴ：野生型；丨Ｂ：注射生理溶液ｂｕｆｆｅｒ的昆虫：ｄｓ－／／＞／？，为注射／ａ／ｒａ／？Ｗ／？ｄｓ－ＲＮＡ的逡逑昆虫。每个实验组取３只幼虫提取总ＲＮＡ，然后各样品取５００ｎｇ逆转录成ｃＤＮＡ，通过逡逑ｑＲＴ－ＰＣＲ检测基因敲减水平，内参基因为／ｔｍＪ基因。Ｐ＜０．００１表示具有极显著差异逡逑（＊＊＊）。逡逑２．４．２邋Ｆｉａｃ／＂、和时空和组织表达模式分析逡逑通过实时荧光定量ＰＣＲ技术，对赤拟谷盗中０／７下游ｖａｃ／／／、0／办％７和逡逑ｇｗＭ三基因进行时期表达模式的分析。由图２．４．２－１可以看出来，３个基因在八逡逑个发育时期中都有表达。以Ｃ／７／基因在早期幼虫和晚期成虫都高表达（图Ａ），逡逑ｆｌＷＷＷ在早期成虫高表达（图Ｂ），也在早期成虫高表达（图Ｃ）。幼虫逡逑和成虫这两个阶段是赤拟谷盗的大量摄食阶段，暗示着这两个基因可能参与解逡逑毒；这三个基因的时期表达为后续进一步探究这三个基因的功能提供了实验依逡逑据。逡逑

虫、ＥＰ邋（ｅａｒｌｙ邋ｐｕｐａｅ）为邋１邋天的踊、ＬＰ邋（ｌａｔｅ邋ｐｕｐａｅ）为邋６邋天的踊、ＥＡ邋（ｅａｒｌｙ邋ａｄｕｌｔ）为邋１邋天逡逑的成虫、ＬＡ邋（ｌａｔｅ邋ａｄｕｌｔ）为２０天的成虫；／７７５Ｊ作为内参基因。逡逑另外，对这三个基因也进行了组织表达模式分析，如图２Ａ２－２，邋除了逡逑头部高表达外，在其它组织中都表达量很低，而头部是重要的解毒器官，暗示逡逑ｖｆｌｄ；／除在神经系统中发挥作用外，可能还具有代谢解毒的功能（图Ａ）。逡逑的组织表达显示，该基因在与代谢解毒相关的表皮中有较高表达水平，说明逡逑与抗性有着密切的关系（图Ｃ），在组织表达中并没有显示与解毒逡逑相关功能，但这并不能排除其可能与药物敏感性功能相关，毕竟，该实验只是逡逑是为后续实验提供了一个预测。．逡逑Ａ邋１２０１邋ｖａｃｈｔ逦Ｄ邋３0ｉ邋ａＷ＞＞３４），逦５ｉ邋ｇｕｓｂ逡逑１邋．邋Ｊｎ逦Ｕ邋１邋２５．逦Ｔ逦｜逡逑＾邋６０．邋ｉ逦十逦Ｉ４．逦［＋１逦？逡逑１邋？逦ｌｉｅ：逦ｌ３＇逦丁逡逑Ｉ邋４0逦｜邋５逦Ｉ２邋＊逡逑°ｌｎ．．ｉ？ｎｎｎ□邋＾邋ｊｎ邋１１ｎｎｎｎｎ逡逑Ｗ逦一、？｜梦、少、＞Ｖ逦少ｖ％、

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本文编号：2744527