基于线粒体基因的锈赤扁谷盗磷化氢抗性机理研究

发布时间：2020-07-11 20:20

【摘要】：锈赤扁谷盗Cryptolestesferrugineus(Stephens)是一种重要的储粮害虫,对主要熏蒸剂一磷化氢的抗药性发展迅速,已经成为制约储粮安全的重要因素。本研究采用FAO推荐的方法,测定不同地理种群C.ferrugineus的抗性水平;基于C ferrugineus转录组测序的数据库信息,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以及快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆获得CPR家族6个表皮蛋白基因的全长序列,利用生物信息学方法分析其核苷酸序列和蛋白质序列;在筛选C.ferrugineus不同发育阶段和不同品系最适内参基因的基础上,研究了 4个线粒体基因的表达模式,以此探索C.errugineus的磷化氢抗性机制。研究结果如下:1.锈赤扁谷盗的磷化氢抗性水平测定采用FAO推荐的抗性测定方法对张家港、成都和太仓的C.ferrugineus种群进行磷化氢毒力测定,结果表明张家港种群(ZJGCF)的LC50为0.079mg/L,抗性系数(Rf)最低,为7.18倍,属低抗性种群;成都种群(CDCF)的LC50为0.126mg/L,抗性系数(Rf)为11.45倍,属中等抗性种群;太仓种群(TCCF)的LC50为20.975 mg/L,抗性系数为1906.82倍,属极高抗性种群。2.锈赤扁谷盗CPR家族表皮蛋白基因的克隆及序列分析基于C.ferrugineus的转录组数据库信息,利用RT-PCR、RACE技术克隆获得了CPR家族的6条表皮蛋白基因的全长序列,分别命名为C1-C6,进而用生物信息学方法分析了各基因结构和序列特征并进行蛋白质同源性分析。Cferrugineus的CPR家族表皮蛋白基因序列的分析数据见表3.2,各基因序列长度分别为C1=704bp、C2=794bp、C3=771 bp、C4=796bp、C5=630bp、C6=711 bp,都具有典型的polyA结构;各基因成熟蛋白序列长度在137～176个氨基酸之间;等电点在4.56～7.10之间;蛋白分子量在14.51～17.81KDa之间;C1具有CPR家族表皮蛋白典型的RR保守结构域:CHIT_BIND_RR_2;C2～C6具有CPR家族表皮蛋白典型的RR保守结构域:CHIT_BIND_RR_1和CHIT_BIND_RR_2;各蛋白都具有几丁质结合区域:Chitin_bind_4;各表皮蛋白均具有信号肽序列,长度为16-18个氨基酸;6个CPR家族表皮蛋白都属于mix型;6个CPR家族表皮蛋白都属于亲水型;C1、C3、C4、C6蛋白都存在跨膜区域,为跨膜蛋白;C2、C5蛋白不存在跨膜区域,为非跨膜蛋白;同源性分析发现获得的氨基酸与其他物种的表皮蛋白具有较高的同源性。3.锈赤扁谷盗内参基因的筛选及验证使用geNorm,NormFinder,Bestkeeper和deltaCt 4种软件评价了锈赤扁谷盗9个内参基因(α-TUB,CycA,EF1α,γ-TUB,GAPDH,RPL13α,RPS13,SDA,β-ACT)在不同发育阶段和不同品系中的最佳内参基因及其组合。结果表明,在不同发育阶段表达最稳定的内参基因RPS13+EF1a,最不稳定的是α-TUB;不同品系在磷化氢胁迫下表达最稳定的基因是RPS13+γ-TUB,最不稳定的是GAPDH和Cyc4。4.磷化氢胁迫下锈赤扁谷盗线粒体基因的表达模式研究利用qRT-PCR方法检测不同品系Cferrugine.s的4个线粒体基因nad3,atp6,cob,cox1的表达模式,结果表明:在未熏蒸条件下,nad3、atp6、cob基因在敏感品系和抗性品系中的表达量有显著差异(P0.05),其中nad3在敏感品系中的表达量是抗性品系的753.29倍,atp6在敏感品系中的表达量是抗性品系的1479.01倍,cob在敏感品系中的表达量是抗性品系的5756.93倍;而cox1在敏感品系和抗性品系中的表达量差异不显著(P0.05)。此外,在磷化氢诱导下,随着时间的延长,nad3、atp6、cob在敏感品系和抗性品系中的表达量均呈现逐渐下降的趋势,而cox1在敏感品系和抗性品系中的表达量均未出现显著变化。以上表明nad3、atp6、cob可能参与了C.ferrugi C.s对磷化氢抗性的形成。
【学位授予单位】：南京财经大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S379.5
【图文】：

气体发生装置,磷化氢

２．１．２．２抗性n,定逡逑参照ＦＡＯ（１９７５）推荐的排水集气装置收集ＰＨ３气体，装置自制，ＰＨ３气体由逡逑磷化锌和１０％的硫酸反应制备而得，发生装置见图２．１。逡逑ＰＨ３气体浓度用ＰＨ３￥体检测O)进行测定。逡逑采用ＦＡＯ（１９７５）推荐的方法，并稍作改动。实验时设定５个浓度梯度（死亡逡逑率在１６％－８４％的浓度范围，通过预实验确定）和１个空白对照，３次重复。先把逡逑试虫放入熏蒸瓶，用高真空硅脂把熏蒸瓶与玻璃旋塞密封。用合适量程的气密性逡逑注射器抽取一定体积的ＰＨ３气体，熏蒸瓶上的橡胶、塞注入熏蒸瓶内，轻轻摇匀，逡逑置于２５°Ｃ、７０％邋ＲＨ的培养箱中密闭熏蒸２０邋ｈ。打开玻璃旋塞，在通风橱中散气逡逑１２逡逑

家族,蛋白信号,表皮,蛋白

图３．３邋６个ＣＰＲ家族表皮蛋白跨膜区域预测逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．３邋Ｔｈｅ邋ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ａｎａｌｙｓｉ?

氨基酸序列,锈赤扁谷盗,家族,表皮

图３．４锈赤扁谷盗６个ＣＰＲ家族表皮蛋白ｃＤＮＡ及相应的氨基酸序列逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．４邋Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ａｎｄ邋ｄｅｄｕｃｅｄ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｓｉｘ邋ｃｕｔｉｃｕｌａｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｏｆ邋ＣＰＲ邋ｆａｍｉｌｙ邋ｉｎ逡逑Ｃ．ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｓ逡逑信号肽用下划线标出．逡逑Ｔｈｅ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｉｓ邋ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ．逡逑

【参考文献】