堆肥菌株Aspergillus fumigatus Z5对稻草的降解及其多糖单加氧酶的异源表达研究
发布时间：2020-10-16 00:44
木质纤维素是自然界中分布最广泛且含量最多的生物质资源,作为植物细胞壁的主要组成部分,结构复杂,难以分解,利用自然界微生物产生的木质纤维素酶来分解木质纤维素,这对解决环境污染,能源危机,食品短缺和人类可持续发展具有重要意义。木质纤维素分解是堆肥过程中主要的生物化学反应,是由微生物分泌的木质纤维酶通过水解作用来完成的,木质纤维素酶活力的大小将直接影响堆肥效率的高低。选择南京农业大学植物营养微生物实验室分离筛选的高效纤维素分解茵 A.fumigatus Z5,将其接种在以稻草秸秆作为唯一碳源的曼德尔培养基中,研究其对稻草的降解,结果显示,稻草秸秆中的纤维素和半纤维素容易分解,木质素较难分解。多糖单加氧酶(PMOs),又称糖苷水解酶家族(GH61),在木质纤维素分解过程中发挥了重要作用。本研究拟采用荧光定量PCR方法研究菌株A.fumigatus Z5中GH61家族基因在不同碳源代谢下的转录差异;通过构建酵母X33表达载体,异源表达菌株Z5中多糖单加氧酶(PMOs)基因,经亲和层析纯化获得重组PMOs蛋白并研究其酶学特性;详尽的阐明PMOs的功能,揭示催化木质纤维素分解及与木质纤维素酶协同作用提高催化效率的机制,为提高堆肥效率提供理论基础。本实验选用的是毕赤酵母表达系统,它能进行蛋白的加工,而且能够进行蛋白折叠,及翻译等修饰作用。而且操作简单、廉价,且表达水平更高。外源蛋白表达水平很高。本试验以毕赤酵母X33作为表达宿主,设计特异性引物,以 A.fumigatus Z5 RNA反转录得到的cDNA分别扩增多糖单加氧酶(PMOs)基因,并连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,最后转化到毕赤酵母X33表达。结果表明,成功得到三种纯化后的多糖单加氧酶(PMOs)蛋白。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S141.4
【部分图文】：
除掉其中部分能被反刍动物较低效率利用外，大多数通过燃烧就地销毁，这??很容易造成环境污染和能源浪费，木质纤维素主要是由纤维素、半纤维素以及木质素??相互铰接而成的（图１－１）?［２，３］。纤维素是一种高聚合度化合物，由成千上万个吡喃葡??萄糖通过Ｐ－１，４－糖苷键连接在一起形成的，其聚合度在很宽的范围，它的分子式为??（Ｃ６Ｈ１Ｑ０５）?［４］，因而来说纤维素的分子量比较大，而且不溶于水及一般有机溶剂，在??常温下，它是比较稳定的，这是因为纤维素分子之间存在氢键的缘故，纤维素在结构??上又可以分为３层［４６１，第一层是单分子层，它是纤维素单分子层也是由葡萄糖组成的??高分子聚合物；第二层是超分子层，就是自组装的纤维素晶体；第三层是原纤结构层，??是由纤维素晶体与无定形的纤维素分子组成的基元原纤等然后再进一步进而组装成??为更大的纤维结构。一般来说大约一百个纤维素葡萄糖残基聚合成结晶度为３－５?ｎｍ的??基元原纤，基元原纤再进一步聚集成截面积为１２ｎｍｘｌ２ｎｍ的微原纤。同时微原纤内??散布着半纤维素，在微原纤的外围还包围着后期合成的木质素。纤维素微原纤再进一??步聚集成更大的大原纤［４７］
堆肥菌株也冷／ｍ＇ｇａｔｏ?Ｚ５对稻草的降解及其多糖单加氧酶的异源表达研究单加氧酶的分类及其木质纤维素分解增效作用??单加氧酶的分类??加氧酶（ＰＭＯｓ）又称为ＧＨ６１家族水解酶，被认为是糖苷水解员［３７］。大多数糖苷水解酶６１家族基因没有水解活性，然而一些酶在二价金属离子及还原剂存在时，可以显著减少木质纤维素水素酶量，不仅可以提高木质纤维的分解速率，而且可以降低功能效应的影响［７’３６Ｉ３８１。ＰＭＯｓ可分为ＰＭＯ－１和ＰＭＯ－２两大类（图ｌ－２）葡萄糖单体的Ｃ－１位置夺取氢原子后形成内酯型糖，接着内酯型酸，被磷酸化后又可以通过磷酸戊糖途径被代谢；而ＰＭＯ－２则的Ｃ－４位夺取氢原子生产非还原端被氧化的醛酮糖［３９］。??－Ｉ￣￣〇ｒ
?不稳定，最终导致糖苷键的断裂，相邻的糖之间发生消除反应，形成糖内酯或醛酮糖??（图１－３）。这种铜依赖酶通过纤维二糖脱氢酶或者小分子还原剂维生素Ｃ来进行氧??化纤维素的作用［４（）４１，５７］。而Ｈａｒｒｉｓ等［３９］的研究发现ＰＭＯｓ有可能是与其他的酶系通过??协同作用来实现促进木质纤维素的分解。他们利用同源表达了两个??ＰＭＯｓ，分别为Ｔｌａｗｒａｎｒｉａｃｗｓ?ＧＨ６１和ｒＪｅｒｒｅｓＺｒｈ?ＧＨ６１Ｅ，当将这两个酶分别力卩至ｌｊ??７＞從．如ＳＭＡ－１３５的胞外酶系后，在相同酶量条件下可以大大提高其对纤维素的水解??效率。Ｑｕｉｎｌａｎ等［４１］研究表明ＴａＧＨ６１?Ａ对ＢＧ有强烈协同作用，ＢＧ本身对玉米秸秆??无水解作用
【参考文献】
本文编号：2842486
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S141.4
【部分图文】：
除掉其中部分能被反刍动物较低效率利用外，大多数通过燃烧就地销毁，这??很容易造成环境污染和能源浪费，木质纤维素主要是由纤维素、半纤维素以及木质素??相互铰接而成的（图１－１）?［２，３］。纤维素是一种高聚合度化合物，由成千上万个吡喃葡??萄糖通过Ｐ－１，４－糖苷键连接在一起形成的，其聚合度在很宽的范围，它的分子式为??（Ｃ６Ｈ１Ｑ０５）?［４］，因而来说纤维素的分子量比较大，而且不溶于水及一般有机溶剂，在??常温下，它是比较稳定的，这是因为纤维素分子之间存在氢键的缘故，纤维素在结构??上又可以分为３层［４６１，第一层是单分子层，它是纤维素单分子层也是由葡萄糖组成的??高分子聚合物；第二层是超分子层，就是自组装的纤维素晶体；第三层是原纤结构层，??是由纤维素晶体与无定形的纤维素分子组成的基元原纤等然后再进一步进而组装成??为更大的纤维结构。一般来说大约一百个纤维素葡萄糖残基聚合成结晶度为３－５?ｎｍ的??基元原纤，基元原纤再进一步聚集成截面积为１２ｎｍｘｌ２ｎｍ的微原纤。同时微原纤内??散布着半纤维素，在微原纤的外围还包围着后期合成的木质素。纤维素微原纤再进一??步聚集成更大的大原纤［４７］
堆肥菌株也冷／ｍ＇ｇａｔｏ?Ｚ５对稻草的降解及其多糖单加氧酶的异源表达研究单加氧酶的分类及其木质纤维素分解增效作用??单加氧酶的分类??加氧酶（ＰＭＯｓ）又称为ＧＨ６１家族水解酶，被认为是糖苷水解员［３７］。大多数糖苷水解酶６１家族基因没有水解活性，然而一些酶在二价金属离子及还原剂存在时，可以显著减少木质纤维素水素酶量，不仅可以提高木质纤维的分解速率，而且可以降低功能效应的影响［７’３６Ｉ３８１。ＰＭＯｓ可分为ＰＭＯ－１和ＰＭＯ－２两大类（图ｌ－２）葡萄糖单体的Ｃ－１位置夺取氢原子后形成内酯型糖，接着内酯型酸，被磷酸化后又可以通过磷酸戊糖途径被代谢；而ＰＭＯ－２则的Ｃ－４位夺取氢原子生产非还原端被氧化的醛酮糖［３９］。??－Ｉ￣￣〇ｒ
?不稳定，最终导致糖苷键的断裂，相邻的糖之间发生消除反应，形成糖内酯或醛酮糖??（图１－３）。这种铜依赖酶通过纤维二糖脱氢酶或者小分子还原剂维生素Ｃ来进行氧??化纤维素的作用［４（）４１，５７］。而Ｈａｒｒｉｓ等［３９］的研究发现ＰＭＯｓ有可能是与其他的酶系通过??协同作用来实现促进木质纤维素的分解。他们利用同源表达了两个??ＰＭＯｓ，分别为Ｔｌａｗｒａｎｒｉａｃｗｓ?ＧＨ６１和ｒＪｅｒｒｅｓＺｒｈ?ＧＨ６１Ｅ，当将这两个酶分别力卩至ｌｊ??７＞從．如ＳＭＡ－１３５的胞外酶系后，在相同酶量条件下可以大大提高其对纤维素的水解??效率。Ｑｕｉｎｌａｎ等［４１］研究表明ＴａＧＨ６１?Ａ对ＢＧ有强烈协同作用，ＢＧ本身对玉米秸秆??无水解作用
【参考文献】
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3 韩雪清,刘湘涛,尹双辉;毕赤酵母表达系统[J];微生物学杂志;2003年04期
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5 陈庆森,刘剑虹,蔡红远,阎亚丽,胡志和,庞广昌;多菌种共发酵生物转化天然纤维素材料的研究[J];天津商学院学报;2000年03期
6 蒋丽雅，王晓芸;松材线虫提取液和分泌液中纤维素酶定性检测[J];森林病虫通讯;1995年03期
本文编号：2842486
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