基于组学对中华绒螯蟹渗透压调节机制的初步研究

发布时间：2020-04-14 20:08

【摘要】：中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹是我国著名的淡水蟹。它体大、营养丰富、肉质鲜美经济价值极高。中华绒螯蟹主要分布于长江中下游及沿海各省,具有生殖洄游的习性,每年秋冬之交,性成熟的个体沿江洄游到河口入海处的咸淡水交汇区交配产卵,幼体在咸淡水中发育成幼蟹,然后溯河而上,经过多次蜕壳,成蟹在淡水中生长。中华绒螯蟹在洄游过程中,环境盐度发生了剧烈的变化,环境盐度对中华绒螯蟹的性腺成熟和生殖洄游有重要的影响。中华绒螯蟹能依靠自身特殊的渗透压调节机理适应外界盐度的变化,为更加清楚的认识中华绒螯蟹的渗透压调节,本研究通过运用比较转录组学和比较蛋白质组学技术,初步探究了短期高盐度胁迫下中华绒螯蟹雄性成蟹后鳃组织的基因转录水平表达和蛋白质表达情况,综合分析了高盐度胁迫下中华绒螯蟹后鳃组织中的能量代谢、信息传导、离子转运、免疫应激、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、细胞骨架蛋白等生物学过程;基于转录组学研究,挖掘出与中华绒螯蟹渗透压调节相关的重要离子通道蛋白钠钾氯协同转运蛋白(NKCC),通过基因克隆技术获得NKCC基因的全长,并且分析了其在中华绒螯蟹不同组织、不同盐度以及不同盐度胁迫时间条件下的表达情况。1.急性高盐度胁迫下中华绒螯蟹后鳃的比较转录组学分析为揭示与中华绒螯蟹渗透调节有关的基因和通路,将雄性成蟹(体重=110±5 g)分别在淡水(FW,0 ppt)和海水(SW,25 ppt)中驯化144h。用RNA-Seq技术分析了蟹后鳃转录组的变化,共获得了174903个unigene。通过对FW组和SW组转录基因的比较,共发现932个差异基因,包括433个上调基因和499个下调基因。GO富集分析表明,与盐胁迫相关的一些重要的生物学过程被显著富集,包括能量代谢、离子转运、信号转导和抗氧化活性。KEGG富集分析将差异表达的基因富集到241个特定的代谢途径,其中与能量代谢、氧化磷酸化和三羧酸循环相关的途径被显著富集。高盐度胁迫改变了参与能量代谢、离子转运、信号转导和抗氧化途径的酶的表达,包括柠檬酸合成酶(CS)、Na~+/K~+-ATPase(NKA)、NKCC、多巴胺受体D1(DRD1)、突触结合蛋白1(STXBP1)、Cu~(2+)/Zn~(2+)超氧化物歧化酶(SOD1)和谷胱氨酸S-转移酶(GST)。实验所获得的转录组测序数据为中华绒螯蟹新基因的鉴定和生理分析提供了理论基础。2.急性高盐度胁迫下中华绒螯蟹后鳃的比较蛋白质组学分析实验一运用转录组技术比较了中华绒螯蟹在高盐度胁迫的生理条件下鳃细胞内所有mRNA的表达差异。蛋白质是机体行使细胞功能的主要物质承担者,蛋白质组能对特定生理条件下的细胞功能和状态做最直接的描述,因此在实验一的基础上,实验二分析了高盐度胁迫后中华绒螯蟹鳃蛋白质表达的变化情况。运用label free蛋白组技术,共鉴定出了1453个蛋白,在2倍差异倍数(FC)阈值条件下,进行差异蛋白筛选,共鉴定出242个差异蛋白,包括122个上调差异蛋白和120个下调差异蛋白。运用GO数据库和KEGG数据库将差异蛋白进行注释和富集,发现差异蛋白在能量代谢、信号转导、离子转运、肌动蛋白细胞骨架、免疫、脂类代谢、氨基酸代谢等生物学功能中显著富集。结果表明,在经过144h的高盐度胁迫后,中华绒螯蟹能量代谢降低,肌动蛋白和细胞骨架蛋白表达增强。在高盐度胁迫下,中华绒螯蟹通过提高免疫和抗氧化能力来应对高盐度产生的氧化损伤。3.中华绒螯蟹NKCC基因的克隆和表达分析NKCC是运输Na~+、K~+和Cl~-的SLC12家族蛋白,在水生动物离子转运和渗透调节中发挥重要作用。本实验运用RT-PCR和RACE技术从中华绒螯蟹后鳃中克隆了NKCC基因;该基因的cDNA全长为4127bp,其中5'非编码区(UTR)长度为18 bp,3'非编码区长度为944bp,开放阅读框(ORF)长度为3165bp,编码1054个氨基酸。理化分析预测其分子量为51.066 kD,理论等电点为4.65。预测中华绒螯蟹NKCC二级结构由12个跨膜结构域组成,同源对比结果显示,中华绒螯蟹NKCC的氨基酸序列与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)NKCC相似度最高,为86.17%。系统进化分析表明中华绒螯蟹NKCC与拟穴青蟹,三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus),可口美青蟹(Callinectes sapidus),蓝蟹(Callinectes sapidus)聚为一支。运用实时荧光定量(qRT-PCR)对中华绒螯蟹NKCC进行组织定量结果表明,NKCC在中华绒螯蟹的鳃、肝胰腺、胃、心脏、肠、血清、眼柄、胸神经结、脑神经结中均有表达,NKCC在中华绒螯蟹肠的表达量最高。在25盐度急性胁迫时,NKCC在中华绒螯蟹肠中的表达量随着胁迫时间延长变化显著,并在胁迫72h后恢复稳定,表明其参与了中华绒螯蟹渗透压调节,并在河蟹的渗透压平衡中发挥重要作用。本结果为进一步研究离子通道在中华绒螯蟹渗透调节的作用机制提供了理论依据。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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本文编号：2627659