对虾病毒性偷死病(viral covert mortality disease,VCMD)和急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)是近年来出现的两种虾类新发疫病,这两种病害的传播流行使我国对虾养殖业遭受了严重的经济损失。研究证实,虾类偷死野田村病毒(covert mortality nodavirus,CMNV)和携带Pir基因质粒的多种弧菌分别是导致VCMD和AHPND的病原。本论文在对我国四种主要养殖虾类包括凡纳滨对虾、斑节对虾、日本对虾和罗氏沼虾感染CMNV状况进行系统研究的基础上,又利用分子生物学、组织学和超微病理分析技术对养殖池塘内、池塘周边野生生物以及来自东海海域的样品等携带和感染CMNV的情况开展了进一步的研究,探讨这些物种是否为CMNV的贮存宿主或媒介生物。同时,本论文也尝试对致急性肝胰腺坏死病副溶血孤菌(Vibrio parahaemolyticus that caused AHPND,VpAHPND)的病原生态学展开了初步研究,通过套式PCR、组织病理切片和组织原位杂交等实验技术分析了养殖三疣梭子蟹自然感染VpAHPND后产生的组织病理变化,并研究了对虾养殖池塘内及周边环境中VpAHPND的贮存宿主或媒介生物。1)针对池塘养殖虾类中CMNV的流行情况开展了调查研究:逆转录巢式PCR检测显示,从患病对虾样品总RNA中能够扩增出与预期大小一致的片段,测序结果证实扩增片段序列为CMNV特征基因序列,基于测序片段序列构建的系统进化树结果也表明上述患病虾类中CMNV株系与CMNV原始株系亲缘关系很近。针对患病凡纳滨对虾、斑节对虾、日本对虾和罗氏沼虾进行组织病理、原位杂交(in situ hybridization,ISH)和透射电镜(transmission electron microscopic,TEM)分析,结果显示,这些虾类样品的肝胰腺组织中均可见肝胰腺小管上皮细胞脱落和核固缩,其中凡纳滨对虾和罗氏沼虾的肌肉组织出现溶解状坏死、肌纤维间排列疏松等病变,肝胰腺和肌肉的病变组织部位中存在CMNV RNA探针的阳性杂交信号,电镜分析结果也证实这些样品的肝胰腺细胞中存在大量散在的CMNV样病毒颗粒。上述结果说明,发生VCMD的养殖凡纳滨对虾、斑节对虾、日本对虾和罗氏沼虾中均存在CMNV感染,感染导致患病个体的肝胰腺和肌肉组织出现了较为严重的病理损伤。2)对对虾养殖池塘内及周边排水渠中野生水母携带和感染CMNV情况进行了调查分析:结果发现,采用逆转录巢式PCR方法可从钩手水母样品总RNA中扩增出CMNV的目标条带,而半月水母样品中无CMNV目标条带扩增出来,32份钩手水母样品中CMNV的阳性检出率为12.5%;目标条带测序和序列比对结果表明,阳性扩增片段的序列与CMNV原始株系对应序列的相似性为99%,系统进化树分析显示,来自钩手水母的CMNV与CMNV原始株系聚为一支;组织病理和ISH分析发现,钩手水母的胃囊、肌肉等组织中均存在不同程度病理损伤,病变组织部位均有明显的CMNV RNA探针的阳性杂交信号;透射电镜分析结果证实,在钩手水母胃囊和肌肉组织中存在大量的CMNV样病毒颗粒。钩手水母作为刺胞动物门的一类生物能够在自然条件下被虾类CMNV所感染,进一步证实CMNV具有跨物种传播的能力。3)对2017年-2018年间我国华北沿海省市对虾养殖池塘内共栖生物中CMNV的感染和流行情况进行了调查研究:在共采集涉及34个物种的100份样品,另外还从东海海域采集了远海梭子蟹样品,对上述样品的分析结果显示,分子生物学分析可检出CMNV阳性的样品包括凡纳滨对虾虾苗、刀额新对虾、沼虾、蜾赢蜚、黑褐新糠虾、天津厚蟹、三疣梭子蟹、钉螺、卤虫、蛆虫、鲫鱼、鰕虎鱼和罗非鱼等13个物种,2017年和2018年沿海对虾养殖池塘共栖生物中CMNV的流行率分别为40.9%和26.8%。逆转录巢式PCR检测和靶基因测序发现,天津厚蟹、中华沙蟹、黑褐新糠虾、中华蜾赢蜚、鲻虾虎鱼和虫蛆等样品均可扩增出CMNV阳性片段,阳性片段序列与CMNV原始株系相应序列的相似性97%以上;系统进化树分析结果显示来自上述样品中的CMNV与CMNV原始株系序列聚为一支,亲缘关系较近;病理分析结果显示,凡纳滨对虾、天津厚蟹、中华沙蟹、沙蚕和远海梭子蟹样品的多个组织内存在病理改变,ISH结果表明上述样品病变组织内存在蓝紫色的CMNV探针阳性杂交信号,TEM分析结果证实在凡纳滨对虾、天津厚蟹、中华沙蟹和沙蚕的体内存在大量的CMNV样病毒颗粒。上述结果表明,CMNV在自然条件下可感染天津厚蟹、中华沙蟹、沙蚕和远海梭子蟹等野生生物种类,这些种类在CMNV传播和流行中可能扮演贮存宿主和媒介生物的作用。4)对山东省潍坊市一虾蟹混养池塘中患病三疣梭子蟹自然感染病原的情况进行了系统分析:采用分子生物学检测方法对三疣梭子蟹样品进行了白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、虾血细胞虹彩病毒(shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV)、VpAHPND、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)、CMNV、黄头病毒(yellow head virus,YHV)和肝胰腺细小病毒(hepatopancreatic parvovirus,HPV)等8种病原的检测,并对样品进行了组织病理和ISH分析。分子生物学检测结果显示,患病三疣梭子蟹样品呈现VpAHPND阳性,而呈现 WSSV、IHHNV、SHIV、EHP、CMNV、YHV 和 HPV 等阴性对样品VpAHPND套式PCR检测第二轮扩增产物进行测序、序列比对以及进化树分析,结果发现扩增产物与致病副溶血弧菌质粒上pirAvp毒力基因核酸片段具有99%的同源性,该序列与已报道的多个致病副溶血弧菌PirA聚在进化树的同一主分支上。组织病理学分析显示,患病三疣梭子蟹的肝胰腺小管上皮细胞坏死,心肌肌纤维呈溶解样病变,鳃丝上皮柱突细胞坏死明显,胸中枢神经节的神经细胞损伤严重,并且这些组织中还可见大量的细胞核固缩现象;原位杂交结果显示,肝胰腺、心肌、鳃组织及胸中枢神经节中的病变部位均存在VpAHPND探针的蓝紫色杂交信号。以上结果表明,虾蟹混养池塘中三疣梭子蟹在自然状态下感染了VpAHPND,并导致肝胰腺、心肌、鳃和胸中枢神经节发生了严重病理损伤。这是首次在养殖三疣梭子蟹中鉴定到VpAHPND感染并揭示感染所致的病理变化,研究结果为揭示VpAHPND自然宿主种类和养殖三疣梭子蟹病害防控提供了基础信息。5)为掌握VpAHPND的宿主和媒介生物种类,本研究对采集自凡纳滨对虾、罗氏沼虾、日本对虾和三疣梭子蟹养殖场及其周边的养殖和野生生物种类包括凡纳滨对虾、天津厚蟹、玻璃海鞘、招潮蟹、挠足类和枝角类、沙蚕、蜾赢蜚、石灰虫、卤虫、藤壶等109份样品进行了检测,2017年和2018年野生生物中VpAHPND的流行率分别为23.5%和26.7%。基于套式PCR和荧光定量PCR的分子生物学分析发现,部分凡纳滨对虾、日本对虾、三疣梭子蟹、天津厚蟹、挠足类和枝角类、蛆虫呈现VpAHPND的阳性,而蛆虾、蜾赢蜚、玻璃海鞘、卤虫、藤壶、沙蚕等呈现阴性;ISH分析结果显示,凡纳滨对虾的肝胰腺、天津厚蟹和沙蚕的肌肉组织中存在大量VpAHPND的阳性杂交信号。上述研究表明,养殖池塘中的凡纳滨对虾、养殖池塘周边排水渠中的天津厚蟹和沙蚕可被VpAHPND感染,后两者在养殖池塘VpAHPND的传播和扩散中可能会起到媒介生物的作用。以上研究表明,我国沿海多省市的养殖对虾包括凡纳滨对虾、斑节对虾、日本对虾和罗氏沼虾中存在CMNV的感染和流行,对虾养殖池塘系统中多种生物具有感染、贮存和传播CMNV的能力,另外CMNV可大幅度跨越物种障碍感染水母,CMNV的这些病原生态学特征提示出VCMD持续危害对虾养殖业的风险不容忽视。同时本研究有关虾蟹混养池塘中三疣梭子蟹可被VpAHPND感染并引起严重病理损伤,以及池塘中多种生物可被VpAHPND感染的结果表明VpAHPND的有效防控也面临媒介生物种类多的挑战。本研究的结果一方面丰富了 CMNV和VpAHPND的病原生态学内容,另一方面也为开展这两种新发疫病的有效防控提供了理论支持。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S945.4
【部分图文】：
第一章 引 言1.1 野田村病毒的研究进展野田村病毒科 Nodaviridae，又称诺达病毒科，因 Nodamura 病毒（NoV）是该科中首个被鉴定的种而得名，Nov 最初是 1956 年从日本东京附近的野田村采集的三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）中分离出来[1, 2]。野田村病毒科包含两个属[3]：α野田村病毒属（Alphanodavirus）和β野田村病毒属（Betanodavirus）。α野田村病毒属的病毒，主要感染昆虫，代表种为 Nov[4]。β野田村病毒属的病毒，目前仅发现于鱼类中，主要可引起鱼类病毒性脑病与视网膜病，代表种为条纹鲹神经坏死病毒[5]。基于野田村病毒 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）氨基酸序列构建的科内病毒成员的系统进化树参见图 1-1[6]。
图 1-2 野田村病毒基因组结构图[8]Fig.1-2 Genomic organization of nodavirusα 野田村病毒属属内病毒成员之间有着相似的物理化学性质，宿主范围却相差很大。α 野田村病毒属中各病毒的原始宿主大多为昆虫[9]，但该属内的 FHV 和Nov 却未见有明显的宿主特异性，其基因组 RNA 能在昆虫[10, 11]、脊椎动物[12]、植物[13]和酵母[14]细胞内复制。早期研究表明，Nov 能够在蚊虫、虱和蛾幼虫中复制，但不引起宿主死亡；Nov 经媒介生物传播，可感染并引起幼年小鼠及幼年仓鼠的瘫痪甚至死亡[1]。目前尚未确定脊椎动物中该病毐的自然宿主种类，但在日本的猪体内分离到其高水平的抗体，说明猪对该病毐的感染和传播可能至关重要[15]。钱东等[4, 16, 17]人通过分析罗氏沼虾肌肉白浊病典型染病虾苗，证实了我国发现的罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus, MrNV）是导致罗氏沼虾肌肉白浊病的病原，MrNV 与法属瓜德罗普岛上的诺达病毒之间，具有较大的同源性。罗氏沼虾诺达病毒主要感染罗氏沼虾，该病毒感染可引起高达 90%的死亡
图 2-1 2017-2018 年间四省市养殖虾类中 CMNV 阳性检出率情况ig. 2-1 Positive detection rate of CMNV in cultured shrimps in four provinces from 2017 to 2018.2.2 CMNV 阳性分离株系统进化树分析利用逆转录巢式 PCR 方法检测样品中 CMNV，部分样品中能够扩增出与预期小一致的目的基因条带，将第二轮 PCR 产物进行胶回收和连接转化实验，测序到 RdRp 目的基因片段序列，将测序结果在 NCBI 网站上面比对分析，发现发病虾的目的基因序列与 CMNV 原始株系 RdRp 目的基因片段的相似性超过 99%，与α野田村病毒属的其它成员的相似性均在 62%以下；基于阳性样品中 CMNVdRp 基因推导氨基酸序列构建系统进化树（图 2-2 和图 2-3）发现，来自发病对虾的 CMVN 序列与 CMNV 原始株系的序列聚在一支，与 CMNV 的亲缘关系较近，α野田村病毒属的其它成员亲缘关系较远。
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