内质网应激介导自噬与凋亡缓解高脂诱导黄颡鱼肠道脂肪沉积的研究

发布时间：2020-05-25 12:52

【摘要】：脂类是鱼类饲料中重要的营养素,高脂饲料导致黄颡鱼肠道的脂肪沉积,但是潜在的机制仍不清楚。我们以黄颡鱼肠道和肠上皮细胞为研究对象,探讨内质网应激、自噬和凋亡介导饲料脂肪诱导的脂肪沉积的机制。研究结果如下:1高脂投喂导致黄颡鱼肠道内质网应激、自噬、凋亡和脂质沉积配制三组不同脂肪含量的饲料,脂肪水平分别为6.98%(低脂饲料),11.3%(适量脂饲料)和15.4%(高脂饲料),饲养黄颡鱼8周。测定肠道甘油三脂含量、脂代谢酶活和脂代谢、内质网应激、细胞自噬和细胞凋亡的mRNA水平。与低脂组和适量组两组,高脂组增加甘油三脂含量和脂代谢酶活(6PGD、ME、ICDH和FAS),上调许多关键基因的表达水平,包括脂肪合成相关基因(6pgd、acca、fas和srebp 1c)、脂肪分解基因(cpt1、accb、hsla和hslb)、脂肪酸转运蛋白ifabp、内质网应激基因(grp78、ire1、xbp1、traf2和atf 6)、自噬相关基因(atg1b、lc3a、lc3b和atg3)和凋亡相关基因(baxa、caspase 3a和caspase 3b)。这表明高脂饲料升高脂肪合成、脂肪分解和脂肪酸转运,诱导内质网应激,激活自噬和凋亡。2内质网应激介导自噬与凋亡缓解脂肪酸诱导黄颡鱼肠上皮细胞的脂质沉积为了深入探讨饲料脂肪影响黄颡鱼肠道脂肪沉积的机制,将分离出的肠粘膜上皮细胞用抑制剂(3-甲基腺嘌呤(3-MA)、4-苯基丁酸(4-PBA)或Ac-DVED-CHO(AC))进行1小时预处理后,在对照溶液或不同浓度的脂肪酸中培养24小时。通过4-PBA预孵育,应用免疫印迹、实时荧光定量、脂合成酶活测定、甘油三脂与脂肪酸含量测定等技术,检测内质网应激对脂肪酸诱导肠上皮细胞的脂肪沉积的影响;4-PBA预孵育肠上皮细胞,应用实时荧光定量、流式细胞术、激光共聚焦、吖啶橙AO染色、caspase 3酶活测定和Annexin V-FITC/PI染色等技术,检测内质网应激与自噬、凋亡的相互作用关系;3-MA预孵育肠上皮细胞,应用流式细胞术、激光共聚焦显微术与透射电镜、吖啶橙AO染色、MDC与Lyso Tracker双染、免疫印迹、实时荧光定量PCR、TG含量测定、BODIPY493/503染色、CPT1酶活测定及HSL与ATGL ELISA试剂盒等技术,检测自噬水平及自噬介导脂肪酸诱导的脂噬水平;Ac-DVED-CHO(AC)预孵育肠上皮细胞,应用免疫印迹、流式细胞术、激光共聚焦显微术、Annexin V-FITC/PI染色、caspase 3酶活、实时荧光定量和TG含量及CPT1酶活测定的技术,检测凋亡水平及凋亡介导脂肪酸诱导的β氧化水平。结果显示,脂肪酸激活内质网应激;内质网应激介导脂肪酸诱导的脂肪沉积,以及自噬和凋亡的激活;自噬介导脂肪酸诱导的脂噬发生。综上所述,内质网应激介导脂肪酸诱导的脂肪沉积,自噬和凋亡;自噬与凋亡介导脂肪酸诱导的脂噬与β氧化降低了脂肪沉积。脂肪酸上调脂肪生成、脂肪分解和脂肪酸转运,诱导内质网应激,激活自噬和凋亡;内质网应激、自噬和凋亡在脂肪诱导的黄颡鱼肠粘膜上皮细胞脂肪代谢变化中起着重要的调节作用。
【图文】：

示意图,未折叠蛋白,信号通路,示意图

第一章文献综述内质网应激的研究进展1 内质网应激及其介导的信号通路研究进展内质网（ER）是一种在真核细胞中具有重要生物合成和信号功能的细胞器网不仅是主要的细胞内 Ca2+储存场所，与 Ca2+内稳态和 Ca2+介导的信号通路密关，而且它还为分泌或嵌入细胞质膜蛋白质的合成、折叠和修饰提供了环境，能够调控脂质代谢（Verkhratsky and Toescu 2003, Marciniak and Ron 2006）。各理和病理条件，包括内质网 Ca2+耗尽（Fu et al 2011）、氧化应激（He et al 200高脂膳食（Kammoun et al 2009b）等，可能导致内质网蛋白折叠负荷和承载力的不平衡，这种情况称为“内质网应激”（Schr der and Kaufman 2005；Ronalter 2007）。

示意图,自噬,信号通路,细胞

图 1.2 内质网应激信号通路与细胞自噬关系示意图（Verfaillie et al 2010）FIGURE 1.2 Crosstalk between UPR signalling pathways and autophagy (Verfaillie et al 2010)有研究表明，内质网应激可以通过多种途径诱导细胞自噬，活化的 PERK，IRE1和 Ca2+浓度的升高都可以诱导细胞发生自噬（Kouroku et al 2007；Maria et al 2007）。Kouroku 等（2007）通过分子干扰试验发现，，干扰 PERK-eIF2 通路的表达可以降低PolyQ72 诱导的自噬，这说明 PERK-eIF2 在内质网应激介导的自噬中起着重要作用。Ogata 等（2006）发现，UPR 反应中的 IRE1 途径在内质网应激诱导的自噬过程中起着重要作用。通过用衣霉素与胡萝卜素处理，同时缺失了 PERK，IRE1 和 ATF6基因的 MEFs 片段，发现只有抑制 IRE1 途径，自噬才会被降低。并同时发现了 IRE1通过细胞浆衔接蛋白 TRAF2 相互作用，激活 JNK 调节细胞自噬（Ogata et al 2006；Kouroku et al 2007；王丛丛 2014）。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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