大弹涂鱼Toll样受体基因的分子克

发布时间：2020-05-27 18:53

【摘要】：大弹涂鱼为广温广盐性鱼类,生活环境充斥着各种各样的病原菌,其中鳗弧菌是一种能够引起水产养殖严重损失的一种致病菌,并且大弹涂鱼生活的两栖环境的盐度变化较为剧烈。先天免疫是抵抗病原体入侵和感染的第一传感器和屏障,Toll样受体是一种重要的先天免疫成员。本文采用生物信息学分析了大弹涂鱼5个TLR基因序列;并且通过鳗弧菌刺激在不同盐度中生活的大弹涂鱼,探究其在不同盐度下受到细菌刺激后的5种TLR基因的表达模式;另外利用所构建的系统发育树进行分子进化分析,探究5种TLR基因的分子进化情况。主要结果如下:(1)大弹涂鱼TLR3基因在结构上具有高度保守性;TLR3基因在大弹涂鱼9个健康组织中(肠、鳃、眼、肾、肝脏、脑、肌肉、脾脏和皮肤)均有表达,但是在肝脏、脾脏和皮肤中具有较高的表达水平;TLR3基因在不同盐度下应对鳗弧菌入侵时都有不同程度的反应,另外,在正常盐度下,在应对病原体入侵时,脾脏反应较快,在高盐度下刚好相反;TLR3基因的位点模型和进化枝-位点模型都没有检测到进化位点。(2)大弹涂鱼TLR5基因在结构上具有高度保守性;TLR5基因在大弹涂鱼9个健康组织中均有表达,在肝脏和脾脏中的表达水平较高;在不同盐度下,TLR5基因在应对鳗弧菌入侵时都有不同程度的反应,在正常盐度下,在病原体入侵时,脾脏反应较快,在高盐度下刚好相反;在正常盐度下,肝脏和脾脏中TLR5的反应速度要快于高盐情况下的反应速度,并且脾脏的反应激烈程度要高于肝脏,而高盐组恰好相反;TLR5的位点模型结果显示有两个进化位点(101H,453N),但是在进化枝-位点模型中未检测到进化位点。(3)大弹涂鱼TLR7、TLR8和TLR9基因在结构上都是保守的;在大弹涂鱼9个健康组织中,TLR7、TLR8和TLR9基因在肝脏和脾脏中的表达水平都相对较高;TLR7、TLR8和TLR9基因在不同盐度下应对鳗弧菌入侵时都有不同程度的反应,在正常盐度下,肝脏和脾脏中TLR7的反应速度都要快于高盐情况下的反应速度,脾脏TLR7的反应激烈程度要高于肝脏,而高盐组恰好相反;与TLR7相反,高盐度胁迫致使TLR8的反应程度比正常组激烈;TLR9在应对鳗弧菌入侵时,肝脏的反应速度要快于脾脏;另外,盐度胁迫致使TLR9在面对鳗弧菌入侵时的反应变得迟缓;利用所构建的TLR7、TLR8和TLR9基因系统发育树进行分子进化分析,位点模型显示在TLR7和TLR9中分别检测到了两个(649Q,674E)和一个进化位点(410S),TLR8未检测到进化位点;进化枝-位点模型结果显示在TLR7(485S)和TLR9(373R)的大弹涂鱼祖先枝各检测到了一个进化位点。综上所述,大弹涂鱼的5个TLR基因在结构上是保守的,在大弹涂鱼9个健康组织中,5个TLR基因均有表达,其中肝和脾中5个TLR基因的表达水平相对较高。此外,在鳗弧菌感染不同盐度环境中的大弹涂鱼后,肝脏和脾脏中5个TLR基因的表达趋势表明TLR基因在应对外部病原体入侵时起到了重要作用,并且盐度胁迫在一定程度上影响了5个TLR基因的反应。根据位点模型结果可知5个TLR基因的进化分析结果表明TLR3和TLR8是高度保守的,而TLR5、TLR7和TLR9在长期进化过程中产生了适应性进化。最后,进化枝-位点模型结果表明,大弹涂鱼的TLR7和TLR9从水生环境向两栖环境的转变的过程中产生了适应性进化。
【图文】：

氨基酸序列,核苷酸,氨基酸序列,结构域

13图 2-1 TLR3 核苷酸和氨基酸序列Fig 2.1 Nucleotide and amino acid sequences of TLR3矩形阴影部分表示起始密码子(ATG)，平行四边形阴影部分表示终止密码子(TAA)，梯形阴影部表示 mRNA 不稳定性结构域(ATTTA)，下划线部分表示 LRR 结构域，双实线部分表示 LRR_TY结构域，实线框部分表示 LRR_CT 结构域，虚线部分表示 TIR 结构域，虚线框部分表示跨膜结域。2.2.2 健康组织中 TLR3 基因的表达量取健康大弹涂鱼的肠、鳃、眼、肾、肝脏、脑、肌肉、脾脏和皮肤进行定量检测如图 2-2 所示，TLR3 基因在所有检测的健康组织中均有表达。此外，TLR3 基因在脏、脾脏和皮肤中具有较高的表达水平，在肾脏、脑和肌肉中的表达量相对较低。

大弹涂鱼,肌肉,表达水平,皮肤

涂鱼的 9 个组织(肠，鳃，眼，肾，肝，脑，肌肉，脾和皮肤)中 TLR3 基因相的相对表达水平The relative expression levels of TLR3 gene for β-actin in the 9 tissues (IntestinalKidney, Liver, Brain, Muscle, Spleen and Skin) of B. pectinirostris注：1.肠道；2.鳃；3.眼；4.肾脏；5.肝脏；6.脑；7.肌肉；8.脾脏；9.皮R3 基因的免疫应答模式 2-3 可知，，在肝脏中，TLR3 基因在对照组和高盐对照组中均无显菌感染后，鳗弧菌组中 TLR3 表达量在 36 h 显着增加并达到最高峰表达量大约为 2.5，一直到 72 h 都显著高于对照组；高盐对照组在 12 h 显著高于高盐对照组，达到最高峰时的相对表达量只有 1.都处于正常水平。在脾脏中，TLR3 基因在对照组和高盐对照组中异；但是当鳗弧菌感染后，鳗弧菌组中 TLR3 在 6 h 和 12 h 迅速上平，然后在 24 h 后降低，在 36 h 后再次增加并维持在较高水平；3 表达量只有在 12 h 显著高于高盐对照组，其他时间点都处于正常
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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