波纹唇鱼芳香化酶基因启动子克隆及活性分析

发布时间：2020-05-29 16:48

【摘要】：波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)属于大型的珊瑚礁暖水性鱼类之一。波纹唇鱼的肉质富含蛋白质、不饱和脂肪酸和多种微量元素,同时味道鲜美,这使得人们过度捕捞波纹唇鱼,一些国际组织已将波纹唇鱼列为濒危物种。为了保护和开发这一种濒危鱼类,我国将波纹唇鱼列为人工繁育对象,而人工繁育的难点在于雌雄比例失调,针对这个问题,本研究探讨波纹唇鱼性别调控机制,为规模化人工繁育波纹唇鱼奠定理论基础。P450芳香化酶由Cyp19al基因编码,是将睾酮转化为雌二醇的关键酶。鱼类的生殖腺原基具有雌性和雄性发展的双向潜力,芳香化酶通过调节雌、雄激素的比例进而参与调节鱼类的性别分化及性腺功能的维持。然而对于社会性反转鱼类的最初“开关”基因及后续调控通路却知之甚少。找到芳香化酶基因Cyp19al的上游调控因子,是顺藤摸瓜揭示这一过程的可行策略,因此本研究社会性礁栖鱼类波纹唇鱼的Cyp19al基因启动子入手开展相关研究。在硬骨鱼当中,存在性腺型Cypl9ala和脑型Cypl9alb两个芳香化酶基因。Cypl9ala与性别调控及性腺发育直接相关;Cypl9alb可能间接影响性别分化。本研究在实验室前期所获得的波纹唇鱼Cypl9ala与Cypl9alb基因cDNA的基础上采用Genome walking技术克隆基因的启动子;使用软件预测其可能的转录结合位点;然后将启动子插入到双荧光素酶表达载体中构建重组质粒;最后,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。本研究获得了波纹唇鱼性腺型Cypl9ala和脑型Cyp19alb基因的启动子序列,长度分别为1119bp与1632bp。预测分析发现其序列上存在许多转录元件:CREB,SRY,Sox5,SRF,TFIID,等转录因子的结合位点以及糖皮质激素受体(GR),雄激素受体(AR),视黄酸受体(PAR),芳香受体(AhR)和视黄醇受体(PXR)等核受体的结合位点。在Cyp19alb启动子上预测到CpG甲基化结合位点及雌激素受体(ER),而Cyp19ala启动子都不具备。这些转录元件可能是波纹唇鱼芳香化酶基因的转录调控位点。启动子活性初步分析表明,不同浓度的雄激素能够使Cyp19ala启动子表达活性提高,而Cyp19alb则无明显变化。不同浓度的雌激素条件下,Cyp19alb启动子活性存在显著差异,这与其含有ER有关,而cyp19ala则无明显变化。本研究为进一步揭示波纹唇鱼芳香化酶基因表达的调控机制奠定基础。
【图文】：

氨基酸序列,甾类激素,家族,芳香化酶

后形成酮类。逡逑血液中血红蛋白具有类固醇激素的结合位点，在雌激素合成过程中起催化作逡逑用。如图１－３，邋ＣＹＰｓ由氨基酸序列的相似性分为多个基因／亚基因家族（Ｓｉｉｔｅｒｉｅｔａｌ．，逡逑１９８２）。ＣＹＰ１１、ＣＹＰ１７调控甾类激素合成从而影响雌激素的形成，而ＣＹＰ１９更逡逑是睾酮转雌二醇的关键工具，这一系列反应将对性别分化产生影响（Ｄａｖｉｄ邋ｅｕｌ．．逡逑１９９８）。逡逑岕？逡逑ｃｖｐｉｉａ｜逡逑ＣＹＰ１７邋ｊ逡逑１７＾５孕试绍＊逡逑ＣＹＰＩ７邋Ｉ逡逑１７＆ＨＳＤｌｔ逦ｊ｜ｌ邋？ＰＨＳＤ逦￡Ｓ；＿Ｓ逡逑雄邋１Ａ：：醉逦Ｚｍ邋ＣＹＰＩ９逡逑图１－３ＣＹＰ１１、ＣＹＰ１７、ＣＶＰ１９家族调控甾类激素合成途径逡逑Ｆｉｇ．１－３邋ＣＶＰｌ邋１．邋ＣＶＰ１７．邋ＣＹＰ１９邋ｆａｍｉｌｙ邋ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｔｅｒｏｉｄ邋ｈｏｒｍｏｎｅ邋ｓ＞邋ｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑１．２．２芳香化酶的分布逡逑脊椎动物（从鱼类到鸟类）的芳香化酶广泛存在脑和性腺等器官组ｔ只中，对鱼逡逑类模式生物进行比较总结，Ｃｙｐｌ９ａｌａ主要在性腺中表达，脑中含量非常细微。逡逑３逡逑

序列,元件,启动子,基因启动子

逦海南大学硕士学位论文逦逡逑１．３芳香化酶的启动子研究概况逡逑１．３．１启动子特点及意义逡逑启动子是位于基因Ｙ端上游区域的一段ＤＮＡ序列，如图１－４。它能够活化逡逑ＲＮＡ聚合酶并且为全酶与模板链合成提供导向，启动基因转录。启动子通过其逡逑序列上的转录结合元件发挥基因转录调控作用。它在基因表达调控顺式元件中的逡逑重要角色，与反式作用因子一类蛋白的相互结合作用，是其调控靶基因转录的体逡逑现。通常我们把真核生物的启动子分为三类：ｒＲＮＡ基因启动子（Ｉ），ｍＲＮＡ基逡逑因启动子（ＩＩ），ｔＲＮＡ基因启动子（ＩＩＩ）。ＩＩ型启动子能够编码蛋白基因，其功能逡逑相对复杂。核心启动子结构存在一个ＴＡＴＡ－ｂｏｘ和起始子（Ｉｎｒ）。ＴＡＴＡ－ｂｏｘ是启逡逑动子最具有代表性的组件，该结构内富含ＡＴ碱基的序列，长度为２５－３０ｂｐ，基因逡逑转录起始的关键所在，是与ＲＮＡ聚合酿ＩＩ识别结合核心区（Ｗａｓｙｌｙｋ邋ｅｔ邋ａｌ．，１９８１：逡逑Ｂａｓｅｈｏａｒｅｔａｌ．，２００４）。但不是每个基因都具有典型的核心启动子的，研究表明，含逡逑有ＴＡＴＡ框的基因启动子序列不超过半数。逡逑！逦邋（ＴＡＴＡｆｉ）逦？止盎逦逡逑
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

【参考文献】