【摘要】：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,SA)是罗非鱼(Tilapia)重要病原之一,具有高发病率和高死亡率等特点,给罗非鱼养殖业造成巨大经济损失,严重制约罗非鱼养殖业可持续健康发展。目前,常用磺胺等抗生素类药物对其进行防治,然而抗生素类药物存在病原耐药和药物残留等风险,应用严重受限。中草药具有多组分多靶点协同作用、不易引起病原耐药、绿色、低毒等优势,被广泛用于水产养殖病害防治中,然而中草药起效慢,对多数急性病症治疗效果较差,制约了其在水产养殖病害防治中的应用。中草药与抗生素联合进行应用,集两者优势,拟补各自的不足被认为最有前途的水产养殖病害防治手段之一。本文前期研究已筛选出具有良好抗无乳链球菌QH-726活性的鸡血藤提取浸膏。在此基础上,采用琼脂扩散法(收录于《中华人民共和国兽药典》)检测9种抗生素抗无乳链球菌QH-726活性,并绘制鸡血藤提取浸膏和具有抗菌活性抗生素的浓度对数与抑菌圈直径间标准曲线,合理设计鸡血藤提取浸膏与抗生素复配方案,并计算各复方相加效应时抑菌圈直径范围,依此为标准,抑菌圈直径大于该范围则认为鸡血藤提取浸膏与抗生素有协同抗菌作用。采用Box-behnken试验设计结合响应面分析优化鸡血藤提取浸膏与抗生素的最佳配比,并采用梯度稀释法分别测定鸡血藤提取浸膏、抗生素和中西药复方的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素3种四环素类抗生素和硫酸庆大霉素、硫酸新霉素、硫酸链霉素3种氨基糖苷类抗生素具有抗无乳链球菌QH-726活性。鸡血藤提取浸膏与硫酸链霉素具有协同抗无乳链球菌QH-726活性。响应面优化获得鸡血藤提取浸膏与硫酸链霉素的最佳复配比为42.5:1(m:m)。鸡血藤提取浸膏、硫酸链霉素和它们复方的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为27.84mg/mL和32.48mg/mL、0.66mg/mL和 0.66mg/mL、5.95mg/mL±0.14mg/mL和 16.15mg/mL±0.3 8mg/mL。采用琼脂扩散法分别测定鸡血藤提取浸膏、硫酸链霉素和它们的复方对4株革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌PBSAR03135、无乳链球菌PBSA06161、海豚链球菌PBSI01168、藤黄微球菌PBML03134和11株革兰氏阴性菌:需钠弧菌CGMCC1.1594、创伤弧菌CGMCC1.1758、溶藻弧菌CGMCC1.1587、哈维氏弧菌PBVH06075、副溶血弧菌ATCC17802、大肠埃希氏菌PBEC05143、荧光假单胞菌PBPF01169、迟缓爱德华氏菌PBET01170、摩氏摩根菌PBMM02141、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104和大肠埃希氏菌CMCC(B)44102的抗菌活性,同时采用梯度稀释法分别测定了复方对以上菌株的MIC和MBC。结果表明:0.24mg/mL硫酸链霉素对4株革兰氏阳性菌均有抗菌活性,对需钠弧菌CGMCC1.1594、创伤弧菌CGMCC1.1758、哈维氏弧菌PBVH06075、副溶血弧菌ATCC17802和大肠埃希氏菌CMCC(B)44102之外的7株革兰氏阴性菌有抗菌活性;27.84mg/mL鸡血藤提取浸膏对藤黄微球菌PBML03134之外的3株革兰氏阳性菌有抗菌活性,对5株革兰氏阴性菌:需钠弧菌CGMCC1.1594、溶藻弧菌CGMCC1.1587、副溶血弧菌ATCC17802、荧光假单胞菌PBPF01169、迟缓爱德华氏菌PBET01170有抗菌活性;5.95mg/mL鸡血藤提取浸膏和0.12mg/mL硫酸链霉素复方对藤黄微球菌PBML03134之外的3株革兰氏阳性菌有抗菌活性,对摩氏摩根菌PBMM02141和铜绿假单胞菌CMCC(B)10104之外的9株革兰氏阴性菌有抗菌活性,该复方在比单方低浓度的情况下抗菌谱较各单方广。鸡血藤提取浸膏与硫酸链霉素复方对15株菌的MIC范围为16.70mg/mL鸡血藤提取浸膏+0.39mg/mL硫酸链霉素～30.62mg/mL鸡血藤提取浸膏+0.72mg/mL硫酸链霉素;而对需钠弧菌CGMCC1.1594、藤黄微球菌PBML03134、摩氏摩根菌PBMM02141、铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌CMCC(B)44102无杀菌活性。对其余10株菌的MBC范围为20.42mg/mL鸡血藤提取浸膏+0.48mg/mL硫酸链霉素～30.62mg/mL鸡血藤提取浸膏+0.72mg/mL硫酸链霉素。采用腹腔注射法建立罗非鱼链球菌人工感染病害模型,并基于该模型分别考察鸡血藤提取浸膏、硫酸链霉素、鸡血藤提取浸膏与硫酸链霉素复方治疗效果。结果表明:中西药复方拌料浓度为5.57g/kg+0.13g/kg(鸡血藤提取浸膏+硫酸链霉素)时,相对存活率最大为80.56%,而此时5.57g/kg鸡血藤提取浸膏和0.13g/kg硫酸链霉素的相对存活率分别为52.63%和13.89%,加和值为66.52%,低于复方相对存活率。虽然鸡血藤提取浸膏对罗非鱼链球菌具有显著疗效,然其使用剂量过大,本文筛出具有协同抗无乳链球菌QH-726活性的鸡血藤提取浸膏和硫酸链霉素复方,该复方可显著降低鸡血藤使用剂量,为开发安全高效防治罗非鱼链球菌病新药做铺垫,为新型安全高效渔药的开发提供新思路。
【图文】：
图２片／化NB）的响应面图和等高线图逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ邋ｓｕｒｆａｃｅｓ邋ａｎｄ邋ｃｏｎｔｏｕｒｓ邋ｏｆ邋Ｙ＝ｆ逡逑通过咚脊分析获得考察范围内复方中单方的最优配比为４２．５：邋１邋（ｍ：ｍ），在此最逡逑复配方案下，平行Ｈ次验证实验，模型预测其与阳性对照的相对浓度为１．２４７３，其逡逑实际值为１．２４２１，相对误差为０．４２％，表明模型显著可靠，该方法确实可行。逡逑．５邋ＭＩＣ和ＭＢＣ测定结果逡逑将配制的４６．４０ｍｇ／ｍＬ鸡血藤提取浸膏、ｌ．Ｏｍｇ／ｍＬ硫酸链霉素、４０．８３ｍｇ／ｍＬ鸡血逡逑提取浸膏和0．９６ｍｇ／ｍＬ硫酸链霉素复方作为初始药液，采用梯度稀释法稀释各试样逡逑始药液样品，，按照２．６方法测定各试样的ＭＩＣ和ＭＢＣ，结果如表３－７所示，中西药复逡逑的ＭＩＣ中鸡血藤提取浸膏浓度为５．％ｍｇ／ｍＬ、硫酸链霉素为０．１４ｍｇ／ｍ＾均盈著低逡逑单方ＭＩＣ，说明鸡血藤提取浸膏与硫酸链霉素间存在显著的协同抑制无乳链球茵活逡逑。逡逑表３－６中西复方对无乳链球菌ＱＨ－７２６的ＭＩＣ与ＭＢＣ逡逑－＊
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S943
【参考文献】
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本文编号：
2702186
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