口服复方中草药（HD-4）定量化控制对虾体内有害菌数量的研究

发布时间：2020-06-24 11:59

【摘要】：我国凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖业自2009年起出现急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND),使整个行业蒙受巨大的损失。研究表明,该病的爆发与凡纳滨对虾体内AHPND致病株副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus,VP_(AHPND))含量超标有关。本文先利用复方中草药HD-4的主要成分—地榆(Sanguisorba officinalis L.)对VP_(AHPND)进行了体外抑菌效果和机理的研究;通过小规模投喂试验探讨了HD-4对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响;并通过生产试验,检验了摄食HD-4后凡纳滨对虾体内弧菌定量化控制的情况。本研究结论为复方中草药HD-4在实际生产中的应用和AHPND防控技术的建立提供了理论支持。1、地榆对VP_(AHPND)生长的影响为探究HD-4对VP_(AHPND)的抑制机理,我们选取HD-4的主要成分(地榆)为研究对象,进行了不同提取方式的地榆药液对VP_(AHPND)的抑制效果和不同浓度地榆醇提物对VP_(AHPND)生长曲线影响的试验。结果显示,地榆水提药液(Ⅰ)、高温处理后的地榆水提药液(Ⅱ)、地榆醇提药液(Ⅲ)和地榆醇提水沉药液(Ⅳ)对VP_(AHPND)抑菌圈直径分别为2.00cm、1.97cm、2.60cm和2.55cm。药液(Ⅰ)和(Ⅱ)对VP_(AHPND)的最小抑菌浓度(MIC)为3.2mg/mL,最小杀菌浓度(MBC)为6.4mg/mL;而药液(Ⅲ)和(Ⅳ)的MIC为1.6mg/mL,MBC也为6.4mg/mL。研究地榆醇提物对VP_(AHPND)生长曲线影响时,在药物与细菌共同培养试验中,空白对照组、0.4mg/mL达到平台期的时间分别为12h、18h;1.6mg/mL组未出现明显的平台期;6.4mg/mL组细菌未能正常生长。在应激培养试验中,各组在用药之前(0-10h)生长曲线变化趋势相同,用药后(10-22h)0.4mg/mL组VP_(AHPND)生长先被抑制后逐渐恢复,20h达到最大值4.14×10~(10)CFU/mL;1.6mg/mL组VP_(AHPND)生长受到显著抑制,出现波动。6.4mg/mL组在用药后副溶血弧菌生长受到显著抑制,在20h时已无可培养的活菌。试验结果表明,地榆对VP_(AHPND)有显著的抑制效果。2、地榆醇提物作用下VP_(AHPND)六种内参基因稳定性评价为筛选适用于研究地榆对VP_(AHPND)抑制机理的内参基因,本文利用qRT-PCR技术探究了地榆醇提物胁迫下副溶血弧菌6种常见内参基因(rec A、pvs A、pvu A、gapdh、16S rRNA、rpo S)的表达情况,利用GeNorm,Norm Finder,Best Keeper,Delta CT以及Ref Finder这5种方法对其表达稳定性进行了评估和筛选。相关结果表明:引物效率E(%)均在1.00±0.08以内,且在不同浓度地榆醇提物处理条件下,这六种内参基因扩增产物特异性也较好。其中Ct值变化差异最小的为16S rRNA(CV=3.88),变化差异最显著的为pvs A(CV=12.53)。5种方法对6种内参基因稳定性排序略有差异,其中GeNorm给出的稳定性排序为rpo S=16S rRNAgapdhrec Apvu Apvs A;Norm Finder结果为gapdhrpo Spvu A16Sr RNArec Apvs A;Best Keeper结果为16S rRNArpo Sgapdhrec Apvu Apvs A;Delta Ct结果为gapdhrpo Spvu A16S rRNArec Apvs A;Ref Finder综合排名结果为rpo Sgapdh16S rRNApvu Apvs Arec A,本章根据配对变异系数结果,最终推荐同时使用rpo S和gapdh作为该条件下内参基因。本研究结果为从基因表达角度研究地榆对VP_(AHPND)作用机理提供数据和理论支持,对建立以地榆为核心药物的AHPND防控技术具有重要意义。3、地榆醇提物对VP_(AHPND)HPND T6SS表达的影响VP_(AHPND)是凡纳滨对虾AHPND的主要病原之一,其致病因子Ⅵ型分泌系统(type VI secretion systems,T6SSs)与该病的发生密切相关。T6SS提供VP_(AHPND)粘附力、环境适应力和种间竞争力,在侵染宿主的过程中发挥重要作用。抑制VP_(AHPND)HPND T6SS的表达,能降低其对宿主的毒力,为AHPND的防控提供有效策略。本章利用qRT-PCR技术探究地榆醇提物对VP_(AHPND) T6SS中相关基因(VP1388、VP1393、VP1400、VP1409、VPA1027、VPA1043和VPA104)表达量的影响,以此探究地榆对VP_(AHPND)的作用机理。结果显示,地榆醇提物能显著抑制VPA1027、VPA1043和VPA1044的转录活性;高浓度的地榆醇提物对VP1388、VP1400和VP1409在短时间内有激活作用,随着时间推移,激活作用逐渐消失;对VP1393基因表达量影响较小。由此推测地榆醇提物可通过抑制副溶血弧菌生长和T6SS功能,来削弱其对宿主的致病力,这为使用地榆防控对虾AHPND的可行性提供了理论支持。4、口服HD-4对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响为了探究HD-4对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响,我们对供试凡纳滨对虾进行小规模投喂试验,并利用Illumina HiSeq高通量测序技术,测定虾苗肠道内菌群结构。结果显示,所有样品中共检测出650种不同的OTUs,其中有238种OTUs为五组样品所有共有。试验前,供试虾苗肠道内主要细菌门包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、软壁菌门(Tenericutes)等。主要细菌目包括黄杆菌目(Flavobacteriales)、弧菌目(Vibrionales)、红细菌目(Rhodobacterales)、支原体目(Mycoplasmatales)等。主要细菌属包括弧菌属(Vibrio)和Spongiimonas等。试验结束后,各分类水平上细菌相对含量都出现了变化,其中,属分类水平上,弧菌属(Vibrio)和Spongiimonas变化最为显著,其相对含量分别降至6.94%和0.54%。试验前后,ACE与Chao1指数显著升高,表明对虾肠道内细菌丰度升高;而Simpson指数的降低和Shannon指数的升高,表明对虾肠道菌群多样性显著升高。通过KEGG功能预测发现,E组比A组外源生物物质代谢和能量物质代谢能力显著提升。本试验表明,HD-4能够显著改善凡纳滨对虾肠道菌群结构,促进营养物质代谢,该结果为HD-4的推广与应用提供了数据支持。5、口服HD-4对凡纳滨对虾体内弧菌的定量化控制及防控示范为了探究卤虫和HD-4在实际生产应用中对凡纳滨对虾体内弧菌数量的影响,本章以固体TSB和TCBS平板培养基上菌落数作为衡量指标,在凡纳滨对虾标粗、养成、亲虾培育以及患病治疗四生理过程中进行HD-4投喂试验。结果显示,仔虾标粗试验中,试验前后给药I组弧菌含量持续下降17.2倍;对照I组和给药II组弧菌数量变化较为平稳;对照II组弧菌数量持续上升34.2倍。对虾养成试验中,试验组弧菌数量随着给药节律出现显著波动,最小值为0CFU/g(3d),最大值为1.89×10~4CFU/g(13d)。对照组对虾体内弧菌数量持续上升,最小值为1.62×10~2CFU/g,最大值为9.93×10~4 CFU/g。亲虾培育试验中,试验组弧菌数量呈波动下降趋势,最小值5.30×10~3CFU/g(10d),较试验开始下降了12.3倍;对照组弧菌数呈波动变化趋势,最小值为5.50×10~4CFU/g(0d),最大值为9.32×10~5CFU/g(7d)。AHPND治疗试验中,试验组弧菌数量呈持续下降趋势,最小值8.22×10~6CFU/g(11d),较试验开始时下降了78.6倍;对照组弧菌数量呈波动变化趋势,实验结束时弧菌数量为1.15×10~8CFU/g。渤海湾地区养殖卤虫体内弧菌数量调研结果表明,鸡粪肥水模式存在安全隐患。施用鸡粪水样中弧菌含量是未施用鸡粪的122倍;施用鸡粪池塘中的活卤虫体内弧菌含量是未施用鸡粪水池中活卤虫的42倍。本试验结果证实了HD-4在实际生产运用中的效果,为以HD-4为核心的对虾AHPND防控技术的建立提供了数据支持。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S945.46
【图文】：

对虾养殖,占比,产量,面积

1.1 我国凡纳滨对虾养殖现状及存在的问题凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国重要的养殖对虾品种之一。其盐度耐受范围广(0.5-50)[1]，最适盐度为 30[2]。1988 年，凡纳滨对虾被引入我国进行人工养殖，因其生长块、产量高、需求旺盛，迅速成为我国对虾主要养殖品种之一。如今，已逐步形成引种、育种、养殖、加工和销售为一体的完整产业链，是我国水产养殖品种中不可或缺的一员[3]。2017 年凡纳滨对虾海水养殖面积共 16.85 万公顷，占全国海水虾类养殖面积的 66.79%；海水虾类苗种共投放 12517.99 亿尾，其中凡纳滨对虾虾苗 9551.81 亿尾，占比 76.30%；全年凡纳滨对虾养殖产量达到108.08 万吨，占海水虾类总产量的 80.34% (如图 1)[4]。近年来，我国凡纳滨对虾养殖产业进入迅猛发展阶段，新品种不断涌现，养殖技术不断跟新，国内市场需求旺盛。但是我国对虾养殖产业还存在一些问题。如种虾资源受到跨国企业的制约，国产苗种质量层次不齐；养殖病害多，发病急，防控难度大；部分虾养殖厂尾水排放不达标，面临停业整顿；对虾产量虽高但个头小，品质差，国际竞争力低等。(a)(b)

肝胰腺,虾苗,综合征,对虾

亚太地区对虾养殖集中地相继发生大面积死亡事件[5]，对整个对虾养殖业均造成了重大损失[6, 7]。该病主要发生于放苗 30d 前后，在短时间内造成虾苗大量死亡[8]，被称为早期死亡综合征(Early mortality syndrome, EMS)[9]。该病于 2009年首次爆发于中国，随后迅速传播至越南(2010 年)，马来西亚(2011 年)、泰国(2012年)、墨西哥(2013 年)、菲律宾(2015 年)、南美洲(2016 年)等地[6, 10-13]。该病主要特征为对虾肝胰腺发白、萎缩、坏死，所以被命名为急性肝胰腺坏死综合征(acutehepatopancreatic necrosis syndrome, AHPNS)，随后更名为急性肝胰腺坏死病(acutehepatopancreatic necrosis disease, AHPND)并沿用至今[6]。目前发现该病主要感染中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)[14]、凡纳滨对虾[15, 16]、斑节对虾(Penaeusmonodon)[17]。发病早期，虾苗肝胰腺发白并开始萎缩，而到了晚期，虾苗肝胰腺表面黑色素沉积，出现黑色条纹或者斑点(图 1-1)，组织病理学检查可见对虾肝胰腺小管上皮细胞脱落，并伴随着血细胞浸润现象(图 1-2)[6]。研究表明该病可通过卤虫进行传播[18]。

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