温度刺激和鳗弧菌感染对牙鲆Hsp90基因表达的影响

发布时间：2020-06-26 16:30

【摘要】：牙鲆Paralichthys olivaceus)是我国的重要海水养殖鱼类,病害频繁发生影响该养殖品种的可持续发展。热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一类在有机体受到高温等逆境刺激后大量表达的伴侣蛋白,在环境胁迫和免疫反应中发挥重要作用,了解牙鲆热激蛋白的作用机制对疾病防治有重要的意义。本研究开展了牙鲆Hsp90α和Hsp90β基因在温度刺激和病原菌感染下表达变化,旨在为牙鲆疾病控制提供理论指导。主要研究内容和结果如下：1. Hsp90基因在不同发育期牙鲆的表达分布：利用实时荧光定量PCR,检测Hsp90α和Hsp90β基因mRNA在不同发育期牙鲆(20g-lKg)的表达分布,结果显示,Hsp90α和Hsp90β在检测的不同发育期牙鲆的13种组织(肝脏、脾脏、头肾、后肾、心、肌肉、皮肤、胃、肠、鳃、腹鳍、脑和血液)中均有表达。在检测的不同发育期牙鲆中Hsp90β的表达水平整体高于Hsp90α;检测还发现在8月龄(200g±50g)牙鲆在肝、鳃、背皮、背肌、腹鳍的Hsp90α表达量要显著高于其他发育期同组织的表达量(P0.05),而Hsp90β在各不同大小牙鲆的表达量也具有明显的差异。2.温度和鳗弧菌感染对牙鲆Hsp90基因表达的影响：选取8月龄牙鲆在5-32℃C刺激1h后,牙鲆肝脏、脾脏Hsp90α在高温(22-32℃)的表达量急骤升高,而Hsp90β在不同温度刺激期间表达量变化较小；在10℃、28℃连续刺激8h,Hsp90α和Hsp90β的mRNA的表现为先升后降的趋势,Hsp90α在高温时的表达量变化幅度明显高于Hsp90β。用鳗弧菌感染8月龄牙鲆,在感染72h内,牙鲆脾脏Hsp90α和Hsp90β的表达量先降后升,Hsp90β上升的幅度明显(P0.05)。结果表明,Hsp90α对高温热应激的反应明显,Hsp90β在对病原菌感染的反应明显。3.牙鲆Hsp90α的原核表达：将Hsp90α基因克隆到pBAD/gⅢA质粒中,构建重组载体pBAD/gⅢA-Hsp90,并转入到大肠杆菌Top10感受态细胞中,经过L-阿拉伯糖诱导表达,对目的蛋白进行Western Blot检测以及做质谱表达分析验证,结果表明重组蛋白得到正确表达,为后续对Hsp90α蛋白的研究提供基础条件。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943
【图文】：

第一个中间状态［１３］（图化）。伴随结构的变化引起相应的闭合状态，结构压缩形成第二个逡逑中间状态Ｍ，其中ＮＴＤ结构域的二聚化与ＭＤ域有关。其中的ＡＴＰ被水解，ＡＴＰ水解后，逡逑将Ｎ－结构域解离，释放ＡＤＰ，Ｐｉ和Ｈｓｐ９０的返回到其原始构型［ｉｓ］（图２ｃ）。逡逑３逦（邋ＮＴＤ逡逑％庐寒ｓ逡逑ｍ逦ｗｗ逡逑Ｅ．邋ｃｏｌｉ逦Ｓ．邋ｃｅｒｅｖｉｓｉｏｅ逦Ｃ邋ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ逡逑（ＰＤＢｃｏｄｅ２１０Ｑ）逦｛ＰＤＢ邋ｃｏｄｅ邋２ＣＧ９）邋（ＰＤＢ邋ｃｏｄｅ邋２０１Ｕ）逡逑图ｌｈｓｐ９０结构规ａ，邋ｈｓｐ９０结构域结构，ｂ，Ｎ－结构域Ｗ黄色示出，Ｍ－域在绿色和Ｃ－结构域为呁逡逑色（引自ＰＤＢ蛋白数据库）逡逑Ｆｉｇ邋１邋ｈｓｐ９０邋ｄｏｍａｉｎ，ａ，邋ｈｓｐ９０邋ｄｏｍａｉｎ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，邋ｂ，Ｎ－邋ｄｏｍａｉｎ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗ打邋ｉｎ邋ｙｅｌｌｏｗ，Ｍ－邋ｄｏｍａｉ打邋ｉｎ邋ｇｒｅｅｎ逡逑ａｎｄ邋ｂｌｕｅ邋Ｃ－邋ｄｏｍａｉｎｓ邋（ｑｕｏｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ＰＤＢ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｄａｌ；ａ邋ｂａｎｋ）逡逑

图４邋２８’Ｃ处理化后牙卿肝脏和脾脏Ｈｓｐ９０邋ｎｉＲＮＡ的表达逡逑巧脏Ｈｓｐ９０ａｍＲＮＡ的相对表达量；Ｂ；巧脏Ｈｓｐ９０ｐｍＲＮＡ的相对表达量；Ｃ：牙辑脾脏Ｈｓｐ９０ａ逡逑的相对表达量；Ｄ：脾脏Ｈｓｐ９０ｐｍＲＮＡ的相对表达量；ａ，邋ｂ，Ｃ，ｄ代表各组之间的差异性，相逡逑为差异不显著（尸＞０．０５），不同字母表示差异显著（户＜０．０５）。逡逑ｅｌａｔｉｖｅ邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋Ｈｓｐ９０邋ｇｅｎｅ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ｌｉｖｅｒ邋ａｎｄ邋ｓｐｌｅｅｎ邋ｏｆ邋＇Ｐ．邋ｏｌｉｖａｃｅｕｓ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ａｔ邋２８邋°Ｃ邋ｆｏｒ逡逑８ｈ逡逑鲜感染橩弧菌后Ｈｓｐ９０基因的表达逡逑

本文编号：2730580