【摘要】：罗非鱼((Oreochromis)原产于热带、亚热带,是联合国粮农组织(FAO)重点推广养殖的国际性鱼类,是当前最重要的淡水养殖品种之一。但罗非鱼性成熟早、繁殖周期短,且具有筑巢、口孵和护幼的繁殖习性,雌雄混养会因繁殖行为消耗大量能量,而影响生长,特别是雌鱼在性成熟后生长极其缓慢,过度繁殖导致池塘种群密度过高,出池规格相差悬殊,商品率低,饲料系数高,大幅降低了罗非鱼产品质量与养殖经济效益。目前,常用单雄性养殖的罗非鱼性成熟早及性成熟后的筑巢和守巢的繁殖习性依然存在,对罗非鱼商品鱼质量和养殖经济效益有一定的影响。为了消除性成熟所带来的不利影响,生产由不育个体所组成的群体是理想的选择。利用促性腺激素释放激素(GnRH)主动免疫可以抑制动物生殖器官发育,促进动物生长、改善肉质、提高生产性能,已在哺乳动物中取得了良好的效果。我们在罗非鱼养殖过程中发现一定比例的不育鱼,其具有生长速度快、肥满度高、性腺(卵巢)严重退化等特点,本研究拟采用GnRH-A抗原主动免疫全雌吉富罗非鱼,研究GnRH-A抗原对罗非鱼生殖功能的调节作用及其机理,探索激素免疫制备不育罗非鱼技术的可行性。本文开展了不育罗非鱼和普通罗非鱼(雌性、雄性)生长性状、性腺发育和激素水平差异研究,选育了全雌吉富罗非鱼家系作为实验材料,合成并制备了 GnRH-A抗原,利用不同剂量抗原免疫全雌吉富罗非鱼,研究罗非鱼生长、性别比例、GnRH抗体水平、血清激素含量(GnRH、FSH、LH、E2、T)、免疫组化指标变化规律,筛选最佳处理剂量进行主动免疫,开展GnRH-A免疫罗非鱼的转录组学和蛋白组学研究。主要研究内容和结果如下:1.研究发现不育罗非鱼的体重、体长均显著大于雌性罗非鱼,也高于雄性罗非鱼,但差异性不显著,三者肥满度的排序为不育罗非鱼雄性罗非鱼雌性罗非鱼,但差异不显著。不育罗非鱼的血清GH和T含量最高,血清E2含量显著低于雌雄罗非鱼,垂体GnRH和血清FSH、LH水平均处于雌雄罗非鱼之间。2.采用激素诱导控制罗非鱼性别的方法,进行了伪雄与全雌吉富罗非鱼家系3个世代的选育,家系选育F3代自然培育罗非鱼的雌性率为99.9%,获得全雌家系6个,甲基睾丸酮诱导全雌家系可获得理论全伪雄罗非鱼家系,F3代罗非鱼选育家系的平均体重提高了 22.97%,最优秀家系(F3-13)的平均体重比对照组提高了 34.32%。伪雄和全雌罗非鱼是育种和实验研究良好的材料。3.根据罗非鱼GnRH的氨基酸序列,设计了用于制备抗原的GnRH-A氨基酸序列(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-{D-Ala}-Leu-Arg-Pro-NHEt),进行人工合成与纯化,获得了目的GnRH-A(纯度:98.38%)。采用碳二亚胺法偶联法、PBS透析法,偶联纯化获得BSA-GnRH-A溶液(浓度:4.7165 mg/mL),UV、SDS-PAGE验证了 GnRH-A多肽与BSA成功偶联。将BSA-GnRH-A复合物与弗氏佐剂(包括弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)按照1:1混合,经充分乳化,制成具有性状稳定、无菌、对罗非鱼无害等特征的CFU-BSA-GnRH-A和IFU-BSA-GnRH-A抗原乳剂。4.以200、100、50、25μg/尾4个不同剂量CFU-BSA-GnRH-A免疫全雌吉富罗非鱼,14天后以相同剂量IFU-BSA-GnRH-A加强免疫一次,测定罗非鱼性别比例、生长性状和脏器指数。结果显示:GnRH-A免疫对罗非鱼生殖系统具有长期持续的影响,直至实验结束,各处理组雌性率持续下降的趋势未见减缓,以100 μg/尾剂量处理组性转变效果最佳;在实验前期处理组罗非鱼生长速度受到抑制,实验结束时基本上恢复到对照组水平;实验70天200μg/尾处理组罗非鱼的肥满度极显著高于对照组,100 Μg/尾处理组罗非鱼肥满度也较高,但与对照组无显著性差异;200 μg/尾处理组性腺成熟系数和脾脏指数显著高于对照组,其他处理组性腺成熟系数低于对照组,但仅有50μg/尾处理组达到了显著水平,50μg/尾处理组罗非鱼的肝脏指数显著低于对照组。5.GnRH-A抗原首免后罗非鱼体内快速产生GnRH抗体,加强免疫导致抗体含量继续升高,并维持显著高于对照组的水平。各处理组血清GnRH含量均在首免后下降再持稳,200、100和50 μg/尾处理组GnRH含量一直极显著低于对照组,25 μg/尾处理组在28天开始低于对照组。各处理组血清FSH和LH含量总体表现为先上升后下降(或持稳)的趋势,实验结束时200、100 mg/尾处理组的FSH、LH含量均与对照组无显著性差异,但低剂量组均极显著高于对照组。处理组和对照组血清E2含量表现为升高趋势,除28、42天,200 μg/尾处理组外,不同时间各处理组的E2水平均显著高于对照组。实验过程中各处理组T含量未见明显的变化规律性,大部分与对照组无显著性差异。6.以4个不同剂量GnRH-A抗原免疫70天后,取罗非鱼垂体和性腺,采用实时定量PCR测定垂体基因表达,用免疫组织化学法对性腺GnRH进行定位与分析。结果显示:各处理组垂体GnRHR mRNA表达量均与对照组无显著性差异;100μg/尾处理组罗非鱼垂体LH-β mRNA表达量(2-ΔΔCT值:1.46±0.20)显著低于对照组(P0.05);50和25μg/尾处理组罗非鱼垂体LH-β mRNA表达极显著高于对照组(P0.01),高剂量处理组与对照组无显著性差异。结合血清对应激素含量分析相关性发现:垂体GnRHR与LH-β基因表达呈显著高度正相关(0.899*),垂体FSH-β基因表达与血清FSH含量呈极显著高度正相关(0.972**),血清中GnRH含量与其他指标相关性均极低,且无显著性相关。罗非鱼性腺中GnRH免疫反应物呈黄色或棕黄色,对照组GnRH阳性细胞数量少,着色浅,各处理组中不育鱼的性腺中GnRH着色较深,阳性细胞多于处理组及对照组的雌性罗非鱼;100、50μg处理组组织化学评分显著高于对照组(P0.05),其他组与对照组无显著性差异。7.以100μg/尾GnRH-A抗原剂量主动免疫罗非鱼,首免70天后采集性腺,采用RNA-seq和DIA技术开展GnRH-A免疫罗非鱼的转录组学和蛋白组学研究。结果显示GnRH-A免疫后,罗非鱼性腺转录组分析获得差异表达基因644个,其中上调基因80个,下调基因564个;蛋白质组分析获得差异表达蛋白1150个,其中上调表达351个,下调表达799个;转录组与蛋白质组差异表达模式一致的基因共209个,其中9个表达上调,200个表达下调,表明GnRH免疫罗非鱼后,抑制了性腺基因的表达,下调基因功能主要集中于single-organism process、binding、cellular process、metabolic process和catalytic activity,涉及的通路主要包括ECM-receptor interaction、Focal adhesion、Cardiac muscle contraction、Oxidative phosphorylation。涉及GnRH信号转导通路的6个差异表达基因均为表达下调。此外,还筛选获得多个GnRH-A免疫罗非鱼后与性腺发育相关的重要功能基因。本研究从分子水平证明了 GnRH-A主动免疫抑制罗非鱼性腺发育的有效性,为阐明GnRH-A抗原免疫的作用机制打下基础。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S965.125
【图文】：
灥逡逑一．邋ｉ逡逑图１－２罗非鱼的性腺（左边为不育罗非鱼，右边为雌性罗非鱼）逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－２邋Ｔｈｅ邋ｇｏｎａｄｓ邋ｏｆ邋ｔｉｌａｐｉａ邋（邋Ｓｔｅｒｉｌｅ邋ｔｉｌａｐｉａ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ，邋ｆｅｍａｌｅ邋ｔｉｌａｐｉａ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ）逡逑２０逡逑
注：同列标注标不同字母表示组间差异显著（Ｐ＜0．0５），相同字母表示组间差异不显著（Ｐ＞０．０５），下同。逡逑３．２罗非鱼生殖器官观察逡逑图１－１罗非鱼外生殖器（从左到右分别是雄性、雌性和不育罗非鱼）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｅｘｔｅｒｎａｌ邋ｇｅｎｉｔａｌｉａ邋ｏｆ邋ｔｉｌａｐｉａ邋（Ｆｒｏｍ邋ｌｅｆｔ邋ａｒｅ邋ｍａｌｅ，邋ｆｅｍａｌｅ邋ａｎｄ邋ｓｔｅｒｉｌｅ邋ｔｉｌａｐｉａ）逡逑灥逡逑一．邋ｉ逡逑图１－２罗非鱼的性腺（左边为不育罗非鱼，右边为雌性罗非鱼）逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－２邋Ｔｈｅ邋ｇｏｎａｄｓ邋ｏｆ邋ｔｉｌａｐｉａ邋（邋Ｓｔｅｒｉｌｅ邋ｔｉｌａｐｉａ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ，邋ｆｅｍａｌｅ邋ｔｉｌａｐｉａ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ）逡逑２０逡逑
ＨＰＬＣ色谱图上，基线稳定呈一条水平直线，提示设备运行正常，主峰峰形良好，逡逑峰形瘦，柱效高，滞留时间稳定，为１２．６１ｍｉｎ，峰面积与进样量呈明显的线型关系，逡逑ＧｎＲＨ－Ａ多肽主峰纯度为９８．３８％邋（图２－２），表明合成的ＧｎＲＨ－Ａ纯度较高。图中出现逡逑了一个负峰可能是由后期流动相吸收本底过高或有空气进入引起。逡逑１逦Ｉ逡逑１邋二逡逑１５Ｃ逡逑！Ｅ－逡逑Ｋ逡逑ｉ：逡逑：逦＾逦ｉＪｉＵ逦逡逑Ｅ邋ｉ邋：逦３邋ｉ邋Ｓ邋？逦７邋ｆｔ邋９逦？邋Ｍ邋１２逦１３邋ｉ？邋？逦？邋Ｔ７邋ｔ＊邋？逦３５逦ｉ邋Ｏ邋ｉｔ逡逑图２－２纯化的ＧｎＲＨ－Ａ色谱图逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋Ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＧｎＲＨ－Ａ邋ｂｙ邋ＨＰＬＣ逡逑（注：洗脱梯度为２２％￣４７％乙腈，３０ｍｉｎ：流速：ｌｍＬ／ｍｉｎ：邋ＵＶ检测波长为２８０ｎｍ。）逡逑３．２抗原偶联结果逡逑以合成纯化的ＧｎＲＨ－Ａ为标准品，采用紫外分光光度法测定ＢＳＡ－ＧｎＲＨ－Ａ浓度，逡逑建立的标准曲线如下图２－３，邋ＧｎＲＨ－Ａ浓度与２２０ｎｍ处对应吸光度的线性回归方程为：逡逑ｙ＝４．２１３ｘ＋０．００２４邋（Ｒ２＝０．９９８）。２２０ｎｍ邋下邋ＢＳＡ－ＧｎＲＨ－Ａ邋样品的三次测量值分别为邋０．２２３、逡逑０．２２４和０．２２３
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本文编号：
2806046
