贝莱斯芽孢杆菌DY-6的抑菌特性及其对刺参生长免疫和池塘菌群结构的影响研究

发布时间：2020-09-29 07:18

　　进入21世纪,刺参养殖业迅猛发展。池塘养殖模式是在山东、辽宁、河北和福建等地区是刺参的主要模式,由于池塘养殖过程中刺参放养密度大、养殖工艺落后、池塘清淤周期长等问题,导致池塘中的生态环境失衡,疾病频发,而使用益生菌,则可以避免上述问题。本文开展了刺参养殖系统中拮抗病原菌的本土益生菌筛选、生理特性及抑菌蛋白的分离纯化等分析,分析了益生菌的最佳使用浓度及其对刺参非特异性免疫酶活力和肠道菌群结构的影响,最后探索分析了益生菌的添加对池塘水质和菌群结构的影响,并对所筛选的菌株进行了全基因组测序研究,以期为益生菌的正确使用提供理论依据。1、一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的分离及其生理特性研究2014年5月,从东营的刺参(Apostichopus japonicus)养殖池塘环境中对水样和底泥样品进行了益生菌的筛选,共获得了66株可培养细菌。以刺参“腐皮综合征”主要致病菌为指示菌进行拮抗作用实验,使用选择培养基对菌株的产淀粉酶和蛋白酶能力进行测定,筛选获得一株潜在益生菌株DY-6,并进行了生理生化实验、16S rDNA序列分析、菌株生长特性及其对刺参的安全性研究。结果表明:DY-6对其指示菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)均有良好的抑制作用,抑菌圈分别达到24 mm、22 mm、27 mm和37 mm,对淀粉和蛋白培养基的水解直径分别为28 mm和20 mm。利用该菌对刺参进行高浓度胁迫实验测试其安全性,实验期间浸浴组和投喂组的刺参状态良好,没有发病和死亡现象。利用细菌生理生化和16S rDNA序列分析表明,DY-6与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis CP015911)的相似性为99%。因此,初步鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。同时,将该菌株与商品化微生态制剂产品中分离的4株益生菌进行了比较,DY-6在温度20~35℃、盐度0~35范围内其生长较快,优于上述4株菌,4 h进入对数生长期,10 h达到生长高峰。筛选的贝莱斯芽孢杆菌DY-6(Bacillus velezensis DY-6)具有良好抑菌能力,生长速度快,并且具有广温广盐的优点,不仅能够降低疾病发生率,还可更好地适应黄河口地区夏季水温偏高、盐度波动大的特点,由此具有良好的益生菌商业化开发潜力。2、贝莱斯芽孢杆菌DY-6对刺参生长、酶活、菌群结构的影响及其相关性分析实验研究了不同浓度贝莱斯芽孢杆菌DY-6添加对刺参增重率、体腔液非特异性免疫酶活力的影响,确定了最佳使用浓度,并利用高通量测序技术分析了该浓度下贝莱斯芽孢杆菌DY-6对刺参肠道菌群结构的影响,实验周期为49 d。实验结果表明:添加贝莱斯芽孢杆菌DY-6的各实验组,刺参的增重率均高于对照组,其中1×10~3 CFU/mL组增重率最高;各实验组的刺参体腔液非特异性免疫酶活力均呈现出不同程度的提高,当添加量为1×10~3 CFU/mL或1×10~4 CFU/mL时刺参的非特异性免疫酶活力提高较大,并在21 d或28 d时达到高峰期。综上,贝莱斯芽孢杆菌DY-6的最佳使用浓度为1×10~3 CFU/mL。利用细菌16S rDNA测序分析方法研究了1×10~3 CFU/mL的添加量对刺参肠道菌群结构的影响,发现贝莱斯芽孢杆菌DY-6的介入使刺参肠道菌群结构处于动态变化的过程,并以28 d为分界,将前后时间点的刺参肠道菌群结构显著分为两类,并在14 d时菌群结构的丰富度最高,21 d时多样性最高。研究还发现:贝莱斯芽孢杆菌DY-6添加后刺参的非特异性免疫酶活力与肠道中的部分细菌存在显著相关性,显著相关的细菌主要集中在Firmicutes,Proteobacteria,Bacteroidetes三个门。3、贝莱斯芽孢杆菌DY-6对刺参养殖池塘水质及水体菌群结构的影响研究了贝莱斯芽孢杆菌DY-6对刺参的生长及养殖池塘水质因子的影响,并采用高通量测序技术分析了养殖水体中细菌群落结构的变化,实验周期为55 d。实验结果表明:与对照池塘相比,添加贝莱斯芽孢杆菌DY-6的实验池塘刺参的增重率和特定增长率均高于对照池塘,分别达到112%,1.36%/d;贝莱斯芽孢杆菌DY-6的使用,能够减低池塘中NO_2-N、COD和NH_3-N的含量,实验后期虽然实验组呈现出上升的趋势,但仍低于对照池塘。基于高通量测序技术分析养殖水体中细菌群落结构表明:投放贝莱斯芽孢杆菌DY-6之前水体样品的细菌物种聚为一类,而投放贝莱斯芽孢杆菌DY-6之后的样品聚为一类,对样品的PCoA主坐标分析可知,未添加贝莱斯芽孢杆菌DY-6之前的W0为一组,添加贝莱斯芽孢杆菌DY-6之后的W1、W2、W3、W4为一组,说明贝莱斯芽孢杆菌使用后水体菌群结构发生了明显变化;Ace指数、Chao1指数、Shannon指数呈升高趋势,说明实验池塘内的水体细菌的丰富度和多样性呈上升的趋势,并在实验最后期的W4组最高;而对各采样时间点水样进行组间的unifrac距离箱线图分析,5次样品中的优势菌均存在显著的差异(P0.05)。4、贝莱斯芽孢杆菌DY-6(Bacillus velezensis DY-6)胞外抑菌蛋白特性分析及细菌全基因组测序采用平板玻璃纸覆盖法,制备贝莱斯芽孢杆菌DY-6的胞外产物和胞内产物,以溶藻弧菌为指示菌,分别检测胞外产物和胞内产物的抑菌活性。结果表明,贝莱斯芽孢杆菌DY-6的胞外产物和胞内产物均能抑制指示菌的生长,且胞外产物的抑菌活性好于胞内产物。同样研究了不同培养时间胞外产物的抑菌活性,结果表明,培养24~72 h后的胞外产物抑菌活性最好;不同浓度的饱和硫酸铵沉淀后的胞外产物的抑菌活性略有不同,当饱和硫酸铵的浓度为60~80%、80%时的抑菌效果优于其他浓度。对贝莱斯芽孢杆菌DY-6进行De Novo全基因组测序,结果表明,菌株DY-6的大小为3.79 M,共预测到3858个ORF,占总基因组长的89.1%。在COG数据库中进行对比,有2487个基因可以找到分类信息,其中2232个可以查找到明确的蛋白功能分类,255个为未知功能蛋白;在GO数据库中比对结果发现,其基因和基因产物属性主要集中在细胞组成,酶催化及代谢等过程。CAZy数据库的注释结果表明DY-6的酶相关基因主要为糖基转移酶和糖苷水解酶等6类,经过试验及分析表明,具有较大的发展研究潜力。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S947.9;S917.4
【部分图文】：

透射电镜,革兰氏染色,菌株,溶藻弧菌

图 2-1 候选菌株 DY-6 的革兰氏染色图 2-2 候选菌株 DY-6 的透射电镜Fig.2-1 The Gram's staining of candidate Fig.2-2 The TEM photograph of candidatstrain DY-6 strain DY-6表 2-1 菌株 DY-6 对病原菌的抑制作用Tab.2-1 The antagonistic activities of candidate strain DY-6菌株名称Strain Name抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)假交替单胞菌P. nigrifaciens灿烂弧菌V. splendidus副溶血弧菌V.parahaemolyticus溶藻弧菌V.alginolyticusDY-6 24 22 27 37

透射电镜,菌株,透射电镜,溶藻弧菌

透射电镜,菌株,病原菌,抑制作用

图 2-1 候选菌株 DY-6 的革兰氏染色图 2-2 候选菌株 DY-6 的透射电镜Fig.2-1 The Gram's staining of candidate Fig.2-2 The TEM photograph of candidatestrain DY-6 strain DY-6表 2-1 菌株 DY-6 对病原菌的抑制作用Tab.2-1 The antagonistic activities of candidate strain DY-6菌株名称Strain Name抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)假交替单胞菌P. nigrifaciens灿烂弧菌V. splendidus副溶血弧菌V.parahaemolyticus溶藻弧菌V.alginolyticusDY-6 24 22 27 37

【参考文献】