溶藻弧菌HY9901Ⅲ型分泌系统效应蛋白的功能研究

发布时间：2020-11-12 17:03

　　 弧菌Ⅲ型系统效应蛋白对宿主细胞具有致病功能,研究效应蛋白的结构功能对研究其致病机理和制作疫苗有重要意义。根据Gen Bank上面溶藻弧菌的基因序列,设计hop Pma J、va1686和type3hy322 3对效应蛋白基因的引物,PCR扩增获得三个基因的全长片段。结果显示:hop Pma J全长345bp,共编码114个氨基酸残基,生物信息学分析表明其不存在信号肽,有蛋白激酶磷酸化等位点,三级结构预测模型为同源二聚体。克隆和测序分析了va1686和type3hy322基因,va1686全长为1164bp,为溶藻弧菌效应蛋白中的膜通透蛋白基因;type3hy322全长为969bp,为溶藻弧菌效应蛋白中的转运蛋白基因。在大肠杆菌表达type3hy322和va1686,得到Type3hy322和Va1686蛋白。通过对溶藻弧菌HY9901 hop Pma J基因的PCR扩增、融合,酶切、连接、转化、菌株接合、同源重组和缺失株筛选,成功能构建缺失株Δhop Pma J,并对Δhop Pma J的生物学表型特征进行了研究,确定突变株具有遗传稳定性。野生株V.alginolyticus HY9901和Δhop Pma J比较,两者生长速率一致,Hop Pma J生物被膜形成能力,胞外蛋白酶活性没有显著变化,Δhop Pma J泳动能力显著减低。Δhop Pma J对斑马鱼的其半致死量LD50为1.2×108cfu/m L,比野生株下降约有两个数量级。对Δhop Pma J在鱼体中的生物安全性及其免疫保护性进行了研究。用106cfu/m L浸泡组30min,28d后,用野生株进行攻毒,免疫保护率为35%,与对照组相比没有显著差异(R≥0.5,p≥0.05)。以105cfu/m LΔhop Pma J注射免疫斑马鱼,28d后,用108 cfu/m L野生株攻毒,免疫保护率为75%,与对照组相比差异显著(R≤0.5,p≤0.05)。提示Hop Pma J减毒后,对宿主的免疫性有良好启动和促进作用。
【学位单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S941.4
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 溶藻弧菌及其疾病
    1.2 溶藻弧菌致病因子
    1.3 Ⅲ型分泌系统
    1.4 弧菌的效应蛋白功能
    1.5 疫苗
    1.6 本研究的目的意义和技术路线
2 溶藻弧菌HY9901 hop Pma J基因的克隆及其生物信息学
    2.1 实验材料
        2.1.1 本实验所采用质粒和菌株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 生物信息学软件
    2.2 实验方法
        2.2.1 溶藻弧菌HY9901 hop Pma J、va1686和type3hy322基因的克隆
    2.3 结果与分析
        2.3.1 hop Pma J基因的全长克隆
        2.3.2 溶藻弧菌HY9901 hop Pma J基因的序列
        2.3.3 溶藻弧菌HY9901效应蛋白Hop Pma J的理化性质
        2.3.4 同源性及进化分析
        2.3.5 功能结构域的预测
        2.3.6 溶藻弧菌基因va1686和type3hy322的克隆
        2.3.7 type3hy322和va1686测序结果和生物信息学分析
    2.4 讨论
3 V.alginolyticus T3SS效应蛋白的原核表达
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 原核表达载体的构建
        3.1.3 大肠杆菌诱导表达和表达条件的优化
    3.2 结果与分析
        3.2.1 type3hy322和va1686基因的原核表达载体构建
        3.2.2 type3hy322和va1686蛋白表达和诱导
        3.2.3 重组表达载体表达条件优化
    3.3 讨论
4 溶藻弧菌HY9901hop Pma J基因缺失株的构建及生物学表型
    4.1 实验方法
        4.1.1 PCR扩增hop Pma J的基因上游序列和下游序列
        4.1.2 hop Pma J缺失片段的融合
        4.1.3 自杀载体构建
        4.1.4 连接和转化
        4.1.5 突变株构建
        4.1.6 第二次同源重组和缺失株筛选
        4.1.7 验证
        4.1.8 突变株HY9901 Hop Pma J的遗传稳定性检测
        4.1.9 HY9901 Hop Pma J的生长速率比较
        4.1.10 Δhop Pma J胞外蛋白酶活性检测
        4.1.11 Δhop Pma J细菌泳动实验
        4.1.12 HY9901 Hop Pma J生物被膜形成能力检测
50)检测'>        4.1.13 Δhop Pma J半数致死率(LD₅₀)检测
        4.1.14 统计学处理
    4.2 结果与分析
        4.2.1 hop Pma J基因的克隆
        4.2.2 缺失株的构建
        4.2.3 缺失株的生物学表型特征
    4.3 讨论
5 突变株作为疫苗在鱼体中的存活能力检测及其免疫保护效果
    5.1 实验材料与方法
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 Δhop Pma J在鱼体中的存活能力
        5.1.3 菌液制备和接种
        5.1.4 免疫保护率的测定
        5.1.5 统计学处理
    5.2 结果与分析
        5.2.1 △hop Pma J在鱼体中的存活能力检测
        5.2.2 免疫保护性
    5.3 讨论
6 结论
参考文献
致谢
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导师简介

【参考文献】

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本文编号：2881001