溶藻弧菌DLDH及DTD表达纯化及弧菌交叉免疫保护研究

发布时间：2023-05-07 14:47

　　以溶藻弧菌HY9901为模板，参照GenBank上登录的其他溶藻弧菌菌株二氢硫辛酰胺脱氢酶基因及D-酪氨酸-tRNA脱酰基酶基因序列设计引物，克隆了溶藻弧菌HY9901菌株的dldh和dtd基因，并对其进行生物信息学分析。结果表明dldh基因含有一个1428bp的开放阅读框，编码475个氨基酸，预测其相对分子量为50.99kDa，理论等电点为5.51，Blast分析发现溶藻弧菌DLDH与副溶血弧菌同源性高达99%，与哈维氏弧菌高达96%。而dtd基因全长435bp，编码144个氨基酸序列，理论分子量为16.09，理论等电点为4.98，Blast分析发现溶藻弧菌DTD与副溶血弧菌同源性高达95%，与哈维氏弧菌高达96%。 将扩增到的dldh与dtd分别亚克隆到pET-32a(+)质粒中，构建pET-DLDH，pET-DTD原核表达质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。蛋白表达条件优化分析，DLDH在37℃，IPTG浓度0.7mmol/L时诱导4h蛋白表达量最大，重组蛋白主要以包涵体形式存在；DTD在37℃，0.1mmol/L的IPTG浓度下诱导5h时重组蛋白以包涵体形式大量表达。蛋...

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
英文缩略词
1 文献综述
    1.1 三种弧菌研究简介
        1.1.1 溶藻弧菌
        1.1.2 哈维氏弧菌
        1.1.3 副溶血弧菌
    1.2 疫苗的研究进展
        1.2.1 传统疫苗
        1.2.2 基因工程疫苗
    1.3 DLDH 及 DTD 的研究进展
        1.3.1 二氢硫辛酰胺脱氢酶
        1.3.2 D-酪氨酰-tRNA 脱酰基酶
    1.4 本研究技术路线
    1.5 研究目的及意义
2 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的克隆与原核表达
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 质粒载体
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器
        2.1.6 生物信息学分析软件
    2.2 实验方法
        2.2.1 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的克隆
        2.2.2 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的原核表达
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的克隆
        2.3.2 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的原核表达
    2.4 讨论
3 DLDH-DTD 融合表达载体的构建与表达
    3.1 实验材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 dldh 及 dtd 基因的扩增
        3.2.2 重叠延伸拼接技术扩增融合基因
        3.2.3 原核表达载体构建及表达纯化
    3.3 结果与分析
        3.3.1 融合基因的扩增及菌落 PCR 鉴定
        3.3.2 原核表达载体构建及表达纯化
    3.4 讨论
4 DLDH、DTD 及 DLDH-DTD 融合基因表达产物对斜带石斑鱼的免疫效果
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株及质粒
        4.1.2 实验鱼体
        4.1.3 实验仪器及试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 亚单位疫苗制作
        4.2.2 安全性评价
        4.2.3 对斜带石斑鱼的免疫保护
        4.2.4 抗体效价检测（间接 ELISA）
    4.3 结果与分析
        4.3.1 安全性评估
        4.3.2 免疫保护率
        4.3.3 血清效价分析
    4.4 讨论
5 DLDH 突变株的构建及功能研究
    5.1 实验材料
        5.1.1 菌株与质粒
        5.1.2 实验仪器
        5.1.3 主要试剂与溶液
    5.2 实验方法
        5.2.1 插入法构建突变株
        5.2.2 突变株的遗传稳定性检验
        5.2.3 突变株与野生株生长曲线的比较
        5.2.4 细菌泳动检测
        5.2.5 酶活测定
        5.2.6 生物膜检测
    5.3 结果与分析
        5.3.1 构建插入突变株及遗传稳定性检测
        5.3.2 插入突变株遗传稳定性检测
        5.3.3 生长曲线的测定
        5.3.4 细菌泳动实验
        5.3.5 酶活测定
        5.3.6 生物膜检测
    5.4 结论
6 结论
参考文献
致谢
作者简介
导师简介



本文编号：3810779