鲤疱疹病毒3型实时荧光定量PCR方法的建立及囊膜蛋白108的表达免疫研究
发布时间：2024-05-15 02:17
锦鲤疱疹病毒病是由鲤疱疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus3，CyHV-3）感染各日龄锦鲤、鲤鱼包括鲤鱼的普通变种（比如框镜鲤）,引起锦鲤、鲤鱼烂鳃病和高死亡率的新病毒病，已引起世界各国的高度关注。锦鲤疱疹病毒病造成的鱼类死亡率高达80-100%，具有高度的传染性，是一类烈性传染病，一旦爆发疫情难以控制。1998年此病在以色列首次发现，随后在全世界十几个国家和地区传播与流行，造成巨大的经济损失。鲤鱼养殖是我国的传统养殖项目，数量多，分布广。锦鲤疱疹病毒病在国内发病频繁，加之运输和商业繁荣，若疫病一处暴发，很快危及整个地区乃至全国的鲤鱼养殖行业，甚至其他淡水鱼类的养殖，造成整个鲤鱼养殖链的瘫痪，给我国的进出口贸易和国民经济带来的损失不可估量。2007年，国家质检总局发布预报，加强对进口锦鲤和鲤鱼的监测力度，要求在进出口贸易活动中把锦鲤疱疹病毒病作为必检项目。 目前的研究成果显示，免疫疫苗是防治锦鲤疱疹病毒病的有效方法，但是我国目前还没有研制出确实、有效的疫苗，在锦鲤疱疹病毒病疫苗研制方面还处于摸索阶段。文献报道，该病的诊断方法有多种。临床应用比较普遍的是通过临床症状以及剖...
【文章页数】：104 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要 Abstract 第一章 前言
1 锦鲤疱疹病毒病研究进展
1.1 鲤疱疹病毒 3 型病原学
1.2 锦鲤疱疹病毒病流行病学
1.3 临床症状
1.4 病理变化
1.5 诊断方法
1.6 预防与控制
2 鲤疱疹病毒 3 型分子生物学研究进展
2.1 基因组特点
2.2 开放阅读框
2.3 毒株的进化
2.4 鲤疱疹病毒 3 型与疱疹病毒的关系
3 原核表达系统
3.1 简介
3.2 原核表达系统在水产方面的应用
4 研究目的和意义 第二章 SYBR GREEN I CYHV-3 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立
1 材料
1.1 病毒和细胞
1.2 主要试剂及耗材
1.3 主要仪器
2 方法
2.1 CyHV-3 的培养
2.2 CyHV-3DNA 的提取
2.3 PCR 阳性标准质粒的制备
2.4 标准品浓度的计算
2.5 重组质粒的稳定性检验
2.6 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立
3 结果
3.1 PCR 扩增目的基因
3.2 重组克隆载体的鉴定
3.4 重组质粒浓度的测定
3.5 重组质粒的稳定性试验
3.6 荧光定量 PCR 循环条件和退火温度的优化
3.7 最佳引物浓度确定和融解曲线分析
3.8 标准曲线的生成
3.9 荧光定量 PCR 反应体系
4 讨论
4.1 实时荧光定量 PCR 标准品的构建
4.2 标准曲线的建立和回归方程的设定
4.3 实时荧光定量 PCR 引物设计
4.4 关于荧光域值的设定
4.5 关于实时荧光定量 PCR 假阳性和假阴性的问题
5 小结 第三章 锦鲤疱疹病毒病流行病学调查
1. 材料
2. 方法
2.1 样品采集及处理
2.2 样品基因组的提取
2.3 荧光定量 PCR 检测
2.4 普通 PCR 对样品的检测
2.5 国家行业标准对部分样品的检测
3 结果
3.1 流行病学调查结果
3.2 国家行业标准对部分样品的 PCR 检测结果
4 讨论
5 小结 第四章 DNA 疫苗在鲤鱼体内组织代谢与分布
1 材料
1.1 实验动物
1.2 病毒、细胞和质粒
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
2 方法
2.1 重组质粒的大量提取及纯化
2.2 重组质粒免疫鲤鱼
2.3 荧光定量 PCR 检测核酸疫苗的组织分布
3 结果
3.1 pIRES-ORF81 质粒的组织分布
4 讨论
4.1 DNA 疫苗在鱼类免疫中的应用
4.2 DNA 疫苗的免疫方法
4.3 DNA 疫苗在机体的分布与代谢
5 小结 第五章 CYHV-3 ORF108 的原核表达及免疫原性研究
1 材料
1.1 病毒和细胞
1.2 主要试剂及耗材
1.3 主要仪器
2 方法
2.1 引物设计
2.2 病毒基因组提取
2.3 ORF108 基因的扩增
2.4 PCR 产物的克隆及鉴定
2.5 重组表达质粒 pET32a-108 的构建
2.6 重组质粒的诱导表达
2.7 表达产物的 SDS-PAGE 分析
2.8 表达蛋白的回收与纯化
2.9 表达蛋白的多克隆抗体的制备及抗体反应原性鉴定
3 结果
3.1 ORF108 基因的 PCR 扩增
3.2 ORF108 基因克隆质粒的鉴定
3.3 重组表达质粒 pET32a-ORF108 的鉴定
3.4 表达产物的 SDS-PAGE 分析
3.5 表达蛋白的抗体的制备及抗体反应原性鉴定
4 讨论
4.1 关于 ORF108 蛋白
4.2 关于原核表达载体
4.3 关于免疫学检测方法
5 小结 结论 参考文献 作者简介 致谢
本文编号：3973751
【文章页数】：104 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要 Abstract 第一章 前言
1 锦鲤疱疹病毒病研究进展
1.1 鲤疱疹病毒 3 型病原学
1.2 锦鲤疱疹病毒病流行病学
1.3 临床症状
1.4 病理变化
1.5 诊断方法
1.6 预防与控制
2 鲤疱疹病毒 3 型分子生物学研究进展
2.1 基因组特点
2.2 开放阅读框
2.3 毒株的进化
2.4 鲤疱疹病毒 3 型与疱疹病毒的关系
3 原核表达系统
3.1 简介
3.2 原核表达系统在水产方面的应用
4 研究目的和意义 第二章 SYBR GREEN I CYHV-3 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立
1 材料
1.1 病毒和细胞
1.2 主要试剂及耗材
1.3 主要仪器
2 方法
2.1 CyHV-3 的培养
2.2 CyHV-3DNA 的提取
2.3 PCR 阳性标准质粒的制备
2.4 标准品浓度的计算
2.5 重组质粒的稳定性检验
2.6 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立
3 结果
3.1 PCR 扩增目的基因
3.2 重组克隆载体的鉴定
3.4 重组质粒浓度的测定
3.5 重组质粒的稳定性试验
3.6 荧光定量 PCR 循环条件和退火温度的优化
3.7 最佳引物浓度确定和融解曲线分析
3.8 标准曲线的生成
3.9 荧光定量 PCR 反应体系
4 讨论
4.1 实时荧光定量 PCR 标准品的构建
4.2 标准曲线的建立和回归方程的设定
4.3 实时荧光定量 PCR 引物设计
4.4 关于荧光域值的设定
4.5 关于实时荧光定量 PCR 假阳性和假阴性的问题
5 小结 第三章 锦鲤疱疹病毒病流行病学调查
1. 材料
2. 方法
2.1 样品采集及处理
2.2 样品基因组的提取
2.3 荧光定量 PCR 检测
2.4 普通 PCR 对样品的检测
2.5 国家行业标准对部分样品的检测
3 结果
3.1 流行病学调查结果
3.2 国家行业标准对部分样品的 PCR 检测结果
4 讨论
5 小结 第四章 DNA 疫苗在鲤鱼体内组织代谢与分布
1 材料
1.1 实验动物
1.2 病毒、细胞和质粒
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
2 方法
2.1 重组质粒的大量提取及纯化
2.2 重组质粒免疫鲤鱼
2.3 荧光定量 PCR 检测核酸疫苗的组织分布
3 结果
3.1 pIRES-ORF81 质粒的组织分布
4 讨论
4.1 DNA 疫苗在鱼类免疫中的应用
4.2 DNA 疫苗的免疫方法
4.3 DNA 疫苗在机体的分布与代谢
5 小结 第五章 CYHV-3 ORF108 的原核表达及免疫原性研究
1 材料
1.1 病毒和细胞
1.2 主要试剂及耗材
1.3 主要仪器
2 方法
2.1 引物设计
2.2 病毒基因组提取
2.3 ORF108 基因的扩增
2.4 PCR 产物的克隆及鉴定
2.5 重组表达质粒 pET32a-108 的构建
2.6 重组质粒的诱导表达
2.7 表达产物的 SDS-PAGE 分析
2.8 表达蛋白的回收与纯化
2.9 表达蛋白的多克隆抗体的制备及抗体反应原性鉴定
3 结果
3.1 ORF108 基因的 PCR 扩增
3.2 ORF108 基因克隆质粒的鉴定
3.3 重组表达质粒 pET32a-ORF108 的鉴定
3.4 表达产物的 SDS-PAGE 分析
3.5 表达蛋白的抗体的制备及抗体反应原性鉴定
4 讨论
4.1 关于 ORF108 蛋白
4.2 关于原核表达载体
4.3 关于免疫学检测方法
5 小结 结论 参考文献 作者简介 致谢
本文编号：3973751
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