斑点叉尾鮰IL-1β基因克隆表达及作为亚单位疫苗佐剂的免疫效果研究

发布时间：2024-12-09 23:33

　　细胞因子是由机体相关免疫细胞产生的,具有生物调节和多种生物学功能的活性物质。近几十年,国内外学者热衷于鱼类细胞因子重组蛋白作为疫苗佐剂研究,结果显示许多种重组细胞因子蛋白如干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-1β(IL-1β)等,都能不同程度的增加灭活苗、弱毒菌、亚单位疫苗等常规疫苗的免疫效应。它在调节免疫应答反应过程中起重要作用,被公认为新型疫苗的较好免疫佐剂。本研究以斑点叉尾鮰白细胞介素-1β(IL-1β)基因为研究对象,成功克隆并表达了IL-1β基因重组蛋白；研究了其作为亚单位疫苗佐剂对斑点叉尾鮰的免疫保护效果。1、斑点叉尾鮰IL-1 β基因克隆及原核表达根据GenBank中公布的斑点叉尾鮰1L-1β1和1L-1β2基因序列(GenBank登录号分别为：DQ160229、DQ160230),运用生物学软件设计特异性引物进行PCR扩增,获得的目的片段IL-1β1和1L-1β2分别克隆至pMD19-T载体；经鉴定正确后用BamH I和Xho 1将目的片段从克隆质粒上切出,连接到表达载体pET-32a(+),获得重组质粒pET-32a...

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1. 鱼用传统佐剂的研究现状
        1.1 油类佐剂
        1.2 矿物质类佐剂
        1.3 微生物来源佐剂
        1.4 动植物来源佐剂
        1.5 免疫刺激复合物佐剂
    2. 鱼类细胞因子佐剂
        2.1 细胞因子佐剂的作用机制
        2.2 细胞因子类基因佐剂的优越性
        2.3 鱼类细胞因子佐剂研究概况
        2.4 鱼类白细胞介素-1β(IL-1β)佐剂研究概况
    3. 选题目的意义
第二章 斑点叉尾鮰IL-1B基因克隆及原核表达
    1. 实验材料
        1.1 试验动物
        1.2 主要仪器
        1.3 质粒和菌株
        1.4 主要试剂
        1.5 主要试剂配制
    2. 实验方法
        2.1 斑点叉尾鮰IL-1β基因的扩增
        2.2 IL-1β基因的T克隆
        2.3 T克隆IL-1β基因的鉴定
        2.4 原核表达载体pET-32a(+)-1β1/1β2的构建
        2.5. 原核表达载体pET-32a(+)-1L-1β1/1β2的表达
        2.6 重组蛋白IL-1β1/1β2的制备与纯化
        2.7 Western-blot检测重组蛋白特异性
    3. 结果
        3.1 斑点叉尾鮰1L-1β1/β2基因的扩增、T克隆和鉴定
        3.2 斑点叉尾鮰IL-1β1/β2基因原核表达载体的构建
        3.3 重组质粒pET-32a(+)-1L-1β1/β2诱导表达、条件优化及纯化
        3.4 Western-blot检测重组JL-1β1/β2的特异性
    4. 讨论
第三章 重组斑点叉尾鮰IL-1B作为亚单位疫苗佐剂的免疫效果研究
    1. 试验材料
        1.1 试验菌株
        1.2 试验动物
        1.3 主要仪器
        1.4 主要试剂
        1.5 主要试剂和培养基的配制
    2. 试验方法
        2.1 抗原制备
        2.2 免疫
        2.3 采血
        2.4 免疫指标检测
        2.5 重组蛋白IL-1β1/2对斑点叉尾鮰细胞因子转录影响
        2.6. 实时荧光定量(Real-time)PCR分析
        2.7 统计学分析
    3. 结果
        3.1 抗体水平检测
        3.2 血清杀菌活性检测
        3.3 ACH₅₀活性检测
        3.4 血清溶菌酶活力检测
        3.5 死亡率和相对免疫保护率
        3.6 Real-time PCR分析斑点叉尾鮰IL-1β和TNF-α的转录表达变化
    4. 讨论
参考文献
致谢



本文编号：4015245