矮牵牛愈伤组织诱导及原生质体分离培养

发布时间：2020-04-02 06:03

【摘要】：矮牵牛(Petunia hybrida)为茄科矮牵牛属的多年生草本花卉,原产于南美阿根廷,花色丰富,可广泛用于室内外盆栽和花坛造景,是世界各国应用最多的草本花卉之一。目前矮牵牛多采用杂交育种技术,而植物原生质体融合技术可克服远缘杂交亲和性差的困难,为矮牵牛新品种的培育开辟新途径。本实验以矮牵牛“梦幻”系列(Petuniahybrida‘Dream’)白色花高代自交系品种SH-2015-1为实验材料,针对矮牵牛愈伤组织诱导、原生质体分离及纯化的技术进行研究,建立稳定的愈伤组织原生质体分离及纯化体系,为进一步的矮牵牛原生质体培养和细胞融合奠定基础,为矮牵牛新品种培育提供种质资源。1.矮牵牛愈伤组织的诱导以矮牵牛无菌苗叶片为外植体,接种到激素组合为MS+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.1 mg/L)的愈伤组织诱导培养基,培养温度(24±1)℃,光照14 h·d~(-1),光照强度3000 lux,6-7 d在中脉和叶缘切口处形成肉眼可见的黄绿色愈伤组织,培养15 d愈伤组织呈团状聚集在培养基的表面,愈伤组织诱导率为67.5%。将诱导出的愈伤组织从初代培养基中转入MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的培养基中进行继代培养,为后续原生质体的分离及纯化研究提供植物材料。2.矮牵牛原生质体的分离及培养(1)原生质体分离体系的建立取继代培养10-15 d的愈伤组织进行原生质体的分离,适宜的酶液组合为2%纤维素酶R-10+0.5%果胶酶Y-23+0.3%离析酶R-10,酶液中添加0.5 mol/L的甘露醇作为渗透压调节剂,愈伤组织黑暗条件下静置酶解12 h,20℃温度下1100 rpm离心2 min,弃去上清液,相同温度和转速下重复洗涤2次,获得纯化的原生质体产量和活性分别达到3.4×10~6个/g和83%。(2)原生质体培养体系的建立本实验通过渗透压浓度、培养密度、激素组合等因素,对矮牵牛愈伤组织原生质体的培养体系进行了初步探讨。实验发现,培养3 d原生质体破裂程度达50%,培养7 d原生质体均溶解分散。有关矮牵牛愈伤组织原生质体培养体系的建立有待进一步研究。
【图文】：

播种育苗,穴盘

（5）脱蜡与显微观察将上述处理完后的切片，连同载玻片一起在通风橱中，用纯二甲苯溶液浸透20 min，，再换入另一纯二甲苯溶液中持续 15 min。最后将脱蜡完的石蜡切片放置在正置显微镜下从低倍到高倍调节物镜观察。2.2 结果与分析2.2.1 穴盘播种育苗矮牵牛于秋季 10 月中旬播种，播种后约 3~5 d 胚根突破种皮，6~10 d 左右发芽。期间保持穴盘的介质湿润，栽培至 20 d 长出 2 片真叶，待其具有 5-6 片真叶时，将小苗根部用基质包裹成根球后移栽定植入花盆中，刚出土时幼苗扎根不耐旱，因此包裹根部的土质要要保持湿润。带土移植优点在于避免根裸露在空气中，对幼苗起到保护作用，促进苗木成活。根毛是植物从土壤中汲取水分的器官，根毛是植物吸水的主要器官，被破坏后会导致幼苗死亡。移植后将幼苗适当的进行遮阴处理，以利于缓苗。

愈伤组织,培养基,播种育苗,穴盘

图 2-2 穴盘播种育苗1：A 培养基中的愈伤组织 2：B 培养基中的愈伤组织 3：C 培养基中的愈伤组织4：D 培养基中的愈伤组织 5：E 培养基中的愈伤组织 6：F 培养基中的愈伤组织Fig 2-2 Seedling in the plug1：Callus in the medium A 2：Callus in the medium B 3：Callus in the medium C4：Callus in the medium D 5：Callus in the medium E 6：Callus in the medium F2.2.3.2 茎段愈伤组织的诱导将带芽茎段接种到诱导培养基上培养 2~3 周左右，愈伤组织在与培养基接触表面的部位和切口处逐渐产生形成。实验共设置 12 个处理组合，各处理诱导形成的愈伤组织情况差异显著。25 d 后观察统计的愈伤组织情况详见表 2-3。结果表明：在不添加激素的 MS 基本培养基上，不能诱导带芽茎段形成愈伤组织，叶片出现变黄萎蔫、部分褐化的现象；在仅添加 6-BA 的诱导培养基上，0.5~2.0 mg.L-1三个浓度的 6-BA 均能诱导少量愈伤组织的形成，并有不定芽的发生。由此可见，6-BA 对于诱导叶片外植体的形态分化十分有利；仅添加 NAA 的培养基上也有少量的愈伤组织形成，但愈伤组织生长极慢，愈伤组织不分化，NAA浓度由 0.1 mg.L-1升至 0.5 mg.L-1时，愈伤组织诱导率呈下降趋势，同时添加 1.0
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S681.9

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