葡萄风信子MYB和bHLH转录因子对花青苷合成的调控研究

发布时间：2020-04-07 07:20

【摘要】：葡萄风信子(Muscari spp.)是一种多年生单子叶植物球根花卉,因其花色主要为不同色系的蓝色而著名,是研究单子叶植物花色形成的好材料。花色是观赏植物的最重要性状之一,花青苷是植物花色呈现的主要物质之一,目前对葡萄风信子的花色在转录调控方面的研究还尚不清楚。本研究在课题组前期葡萄风信子(Muscari armeniacum)转录组数据库的基础上,筛选出与花色形成相关的两个R2R3-MYB和一个bHLH转录因子基因,首先对这些基因进行了克隆和基本特性分析;其次通过双分子荧光互补(BiFC)试验验证了R2R3-MYB与bHLH转录因子互作;再通过双荧光素酶试验分析了MYB-bHLH复合物对花青苷合成途径结构基因的调控作用;最后在烟草(N.tabacum‘NC89’)中研究了R2R3-MYB基因在调控花青苷合成中的功能,为揭示葡萄风信子花色形成的调控机制提供依据,为葡萄风信子花色改良和分子育种提供有价值的基因。主要获得了以下研究结果:(1)筛选克隆了两个葡萄风信子花色相关R2R3-MYB转录因子基因MaMybA和MaAN2,对其基本特性进行了分析。从葡萄风信子转录组数据库中筛选获得了两个与花青苷相关的R2R3-MYB unigenes,采用RACE方法获得了cDNA全长,并分别命名为MaMybA和MaAN2。MaMybA cDNA全长778 bp,开放阅读框(ORF)编码237个氨基酸,GenBank登录号为:MF663728。MaAN2 cDNA全长802 bp,ORF编码240个氨基酸,GenBank登录号为:KY781168。通过序列比对分析表明,MaMybA与MaAN2均在序列的N端高度保守,均含有双子叶植物调控花青苷合成的R2R3-MYBs典型的保守氨基酸(R、V和A)和与R-like bHLH蛋白互作的保守基序([D/E]LX_2[R/K]X_3LX_6LX_3R);在其C端,含有与花青苷合成相关的特征基序([K/R]P[Q/R]P[Q/R])。若考虑氨基酸全长时,MaMybA和MaAN2的一致性仅为43.5%。聚类分析表明它们均属于调控花青苷合成的R2R3-MYB转录因子家族的AN2亚组,但分支不同。它们均定位于细胞核中,在酵母中具有转录激活活性。MaMybA和MaAN2的转录表达具有组织特异性,在花中优势表达,且与花发育进程花青苷积累的变化趋势相关,但MaMybA的表达稍比MaAN2提前。(2)筛选克隆了一个葡萄风信子花色相关bHLH转录因子基因MabHLH1,并通过BiFC试验验证了转录因子bHLHs与R2R3-MYBs互作。利用已知调控花青苷合成的bHLH蛋白通过本地BLASTP从葡萄风信子转录组数据库中深度挖掘出一个与花青苷相关的bHLH unigene,采用RT-PCR方法克隆获得了MabHLH1的cDNA。MabHLH1 ORF全长2001 bp,编码666个氨基酸,GenBank登录号为:MF663728。Mab HLH1在氨基酸序列的N端含有高度保守的MYB互作区域和在C端含有bHLH结构域。聚类分析表明MabHLH1聚类到bHLH转录因子家族Ⅲf亚组LC/JAF13/DEL簇。该转录因子定位于细胞核中,在酵母中具有转录激活活性。MabHLH1在葡萄风信子不同组织器官中组成型表达。Bi FC试验验证了MabHLH1和拟南芥调控花青苷合成的bHLH转录因子AtTT8均能分别与MaMybA和MaAN2在体内互作。(3)MaMybA或MaAN2与bHLH蛋白共表达,调控花青苷合成途径晚期结构基因的表达。双荧光素酶试验结果表明,单独表达35S:MaMybA不能激活花青苷合成途径早期结构基因的启动子,但能激活晚期结构基因MaDFR和MaANS启动子;相较于单独表达,35S:MaMybA与35S:MabHLH1或35S:AtTT8共表达,可轻微提高MaDFR和MaANS启动子活性。单独表达35S:MaAN2或35S:MabHLH1不能激活早期和晚期结构基因的启动子;35S:MaAN2与35S:MabHLH1或35S:AtTT8共表达时,能明显调控MaDFR和MaANS的表达。(4)MaMybA和MaAN2均能在烟草中调控花青苷合成,但花青苷积累强度和成分不同。通过农杆菌介导叶盘法在烟草‘NC89’中过量表达MaMybA(OE-MaMybA)和MaAN2(OE-MaAN2),可使烟草不同器官积累不同强度的花青苷。OE-MaMyb A烟草叶片、花冠和花冠筒、花药、花丝、花萼呈深紫红色,子房壁和种皮有少量花青苷积累;OE-MaAN2烟草叶片呈深红色,花冠呈深粉红色,花药、花萼、子房壁和种皮呈深红色。通过显微观察发现,不同基因型烟草花青苷的细胞组织定位和表皮细胞形态无明显差异。通过UPLC-Triple-TOF/MS方法鉴定,OE-MaMybA和OE-MaAN2烟草叶片和花冠中的花青苷成分不同。OE-MaMybA烟草叶片和花冠的花青苷组分主要有Cy3R和Dp3R,OE-MaAN2烟草叶片和花冠以及对照烟草花冠中花青苷组分主要为Cy3R,对照叶片中未检测到花青苷。通过HPLC标准品定量的方法测定花青苷含量,结果表明,叶片和花冠的花青苷含量均在OE-MaMybA烟草中最高,在OE-MaAN2烟草中次之,在对照烟草中最低。实时定量PCR结果表明,OE-MaMybA和OE-MaAN2烟草叶片和花冠中几乎所有花青苷代谢途径结构基因以及内源bHLH基因都上调表达。值得注意的是,NtF3’5’H在OE-MaMybA烟草叶片和花冠中的转录本与对照和OE-MaAN2的相比明显增加。因此,OE-MaMybA烟草之所以呈现出比OE-MaAN2烟草更深的颜色,主要是由于前者产生了以Dp3R为主的新花青苷和高浓度的花青苷含量。
【图文】：

示意图,花青苷,代谢途径,示意图

图 1-1 花青苷代谢途径示意图早期结构基因 (EBGs) 编码的酶用黄色矩形框表示，即 CHS：查尔酮合成酶，CHI：查尔酮异构酶，F3H：黄烷酮 3-羟化酶，F3’H：类黄酮 3’-羟化酶，F3’5’H：类黄酮 3’5’-羟化酶，，FLS：黄酮醇合成酶；晚期结构基因 (LBGs) 编码的酶用粉红色椭圆形表示，即 DFR：二氢黄酮醇 4-还原酶，ANS：花青素合成酶，UFGT：尿苷二磷酸：类黄酮糖基转移酶，MT：甲基转移酶，MYBs：MYB 转录因子，bHLHs：螺旋环螺旋蛋白，WDR：WD 重复蛋白。Figure 1-1 A schematic diagram of the flavonoid biosynthetic pathway leading to anthocyaninsThe early biosynthetic genes (EBGs) encoding enzymes shown in yellow rounded rectangle are as follows:CHS, chalcone synthase; CHI, chalcone isomerase; F3H, flavanone 3-hydroxylase; F3’H, flavonoid3’-hydroxylase; F3’5’H, flavonoid 3’5’-hydroxylase. FLS, flavonol synthase. The late biosynthetic genes(LBGs) encoding enzymes shown in pink oval are as follows: DFR, dihydroflavonol 4-reductase; ANS,anthocyanidin synthase; UFGT, uridine diphosphate: flavonoid glycosyltransferases; MT, methyltransferase; MYBs, MYB transcription factors; bHLHs, basic Helix-Loop-Helix proteins; WDR, WDrepeat protein.1.2 植物花色与花青苷广义的花色是指整个花器官 (即花萼、正常花瓣、雄蕊、雌蕊、苞片以及它们发育

示意图,家族,植物,二级结构

将 MYB 家族转录因子分为 4 种类型 (图1-2; Dubos et al. 2010; Du et al. 2012)：(1) 1R (R1/2, R3-MYB)，主要参与形态建成、次生代谢、生物钟调节、生理胁迫响应以及花和果实的发育 (Feller et al. 2011)。(2) 2R(R2R3-MYB)，它们形成了植物 MYB 转录因子的最大亚家族。它们主要参与植物一级和次生代谢、决定细胞分化、激素信号转导、调控植物生长发育以及响应生物和非生物胁迫 (Dubos et al. 2010)。(3) 3R (R1R2R3-MYB)，这类 MYB 转录因子主要存在于绝大多数真核生物基因组中，主要与细胞周期的调控有关 (Haga et al. 2007)。(4) 4R (含有 4个 R1/R2-like repeats)，对于它们的功能还不清楚 (Dubos et al. 2010)。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S682.29

【引证文献】