辣椒疫霉6个RxLR和大豆疫霉1个CRN效应子的功能分析

发布时间：2020-04-08 21:01

【摘要】：疫霉菌(Phytophthora)能侵染几乎所有的双子叶植物,对农业、林业以及生态环境造成严重危害。辣椒疫霉(Phytophthora capsici)和大豆疫霉(Phytophthora sojae)是其重要成员。病原卵菌在侵染宿主植物时会分泌大量的效应子来促进侵染,这些效应子主要包括RxLR和CRN两大类。本研究通过对辣椒疫霉6个RxLR效应子和大豆疫霉1个CRN效应子进行功能分析,初步揭示了这些效应子在致病中的作用。本研究主要获得如下结果:辣椒疫霉中RxLR242同源基因的鉴定与功能分析:辣椒疫霉中单个RxLR效应子与寄主和非寄主的互作情况少有报道。前期的结果表明,RxLR242能引起细胞坏死;沉默RxLR242提高了辣椒疫霉对寄主植物本氏烟的侵染能力,且能侵染非寄主植物普通烟。本研究在辣椒疫霉3个不同的菌株中共鉴定到14种RxLR242的同源基因,但是它们只编码7种RxLR242蛋白。随后在本氏烟和普通烟中分别瞬时表达这7种蛋白,发现其中5种能诱导细胞死亡,2种不能。同时,通过蛋白序列比对分析发现7种同源蛋白表现出诱导细胞坏死活性的分化可能是由于第101位氨基酸由亮氨酸(L)突变成精氨酸(R)所致。进一步研究发现,2种不能诱导细胞死亡的蛋白能抑制其他5种蛋白所诱导的细胞死亡。以上结果说明,RxLR242在辣椒疫霉不同菌株中存在多态性;不同RxLR242同源物之间存在诱导细胞死亡活性的分化,并且这种分化可能是由于单个氨基酸突变所致;不能诱导细胞死亡的同源物蛋白有抑制诱导的细胞死亡的活性。辣椒疫霉中5个RxLR效应子的功能研究:辣椒疫霉中RxLR效应子在辣椒疫霉中的毒性功能尚不清楚。前期通过烟草瞬时表达发现RxLR22、RxLR25和RxLR103能引起细胞坏死,同时利用酵母双杂系统鉴定出RxLR103、RxLR172能与抗性相关蛋白互作。为了检测这些基因对辣椒疫霉毒性的影响,通过原生质体转化的方法对上述基因进行沉默,进一步通过致病性分析和菌丝定殖检测发现,沉默这5个基因都显著降低了辣椒疫霉的致病力。以上结果说明,辣椒疫霉中的5个RxLR基因在辣椒疫霉侵染宿主植物的过程中发挥着毒性功能。PsCRN161通过上调表达抗性相关基因来提高植物对生物和非生物胁迫的耐受性:本研究前期证明,大豆疫霉中的PsCRN161具有细胞死亡抑制活性,PsCRN161定位在宿主植物细胞核,PsCRN161转基因植株抗病性以及耐旱、耐盐的能力有所提高。但是其分子机制依然不清楚,为了解析其分子机制,本研究通过数字基因表达谱分析发现,PsCRN161转基因植株中出现一系列抗性相关的差异表达基因,包括ABC转运蛋白基因、细胞素P450基因和细胞受体类激酶(RLK)基因等,选取其中有代表性的基因进行定量检测,结果发现与数字基因表达谱相似,这些抗性相关基因在PsCRN161转基因植株中显著上调表达。以上结果说明PsCRN161可能是通过正向调控抗性相关基因来的表达来提高植物对生物和非生物胁迫的耐受性。
【图文】：

由于沉默转化子存在恢复的风险，所以采用实时定量ＰＣＲ的方法重验Ｍａｆｕｒａｈ逡逑获得的３个兄的转化子，包括１个未沉默转化子和２个沉默转化子。三次生逡逑物学重复验证后，发现只有转化子Ｔ２９依然是沉默的，沉默效率为６０％邋（图２－２Ａ）；逡逑Ｔ２９与之前比沉默效率有所上升，其余２个转化子的表达量要明显高于辣椒疫霉野生逡逑型ＬＴ２６３。因此，转化子Ｔ２９是基因ＲＸＬＲ２４２的沉默转化子。逡逑前期研究证明沉默／ＬＹＩＸ２７２基因能提高辣椒疫霉对植物的致病力（Ｍａｆｕｒａｈ邋ｅｔ邋ａｌ．逡逑２０１４）。我们将沉默转化子Ｔ２９和辣椒疫霉野生型分别接种在本氏烟左右两边相同的逡逑位置，３６小时后紫外灯下拍照并统计数据。三次生物学重复后，结果发现沉默转化子逡逑Ｔ２９在本氏烟上引起的病斑要明显大于野生型所引起的病斑（图２－２邋Ｂ，Ｄ）。为了进逡逑一步证明结果的可靠性，对沉默转化子Ｔ２９和辣椒疫霉野生型接种点的菌丝定植量进逡逑行检测。定量ＰＣＲ的结果显示，沉默转化子Ｔ２９在烟草叶片中的菌丝含量要显著高逡逑于辣椒疫霉野生型的菌丝含量（图２－２邋Ｃ）。因此

在ＬＴ２．６３中有８种不同序列，ＬＴ５１和ＰＣ３５中有各有４种不同的序列（表２－５）。通逡逑过序列对比发现，这１４种序列的相似度超过８５％，同个菌株内相似度更高，特别是逡逑在ＬＴ５１和ＰＣ３５这２个菌株内部达到９５％以上（图２－４，２－５，２－６），在ＬＴ２６３菌株中逡逑序列和与其他６种序列差别最大。逡逑由于序列相似度极高，所以根本无法用引物扩增的方法将其一一区分，于是根逡逑据序列的保守区段设计出了能检测所有同源基因的定量引物（表２－１）。逡逑通过荧光定量ＰＣＲ的方法分别检测了辣椒疫霉３个菌株中所有同源基因在逡逑不同侵染阶段的表达情况。发现基因的表达模式在辣椒疫霉３个菌株中的趋逡逑势相似，都表现为侵染前期大幅度上调表达且表达量达到最大值，中后期表达量下调；逡逑但是不同菌株在相同侵染阶段的表达量差异显著，表现为在ＬＴ２６３中表达量最高、逡逑ＰＣ３５次之、ＬＴ５１最低（图２－３）。逡逑进一步分析发现，这１４种不同的基因序列只编码７种不同的蛋白序列，其中将逡逑Ｍａｆｂｒａｈ等报道的效应蛋白（ＭａｆＵｒａｈｅｔａｌ．２０１４）编号为ＲｘＬＲ２４２－７。这些逡逑蛋白序列在不同的菌株中的分布也是有差异的，ＬＴ２６３菌株中最多有６种，ＬＴ５１中逡逑有４种，ＰＣ３５中有３种；其中有３种蛋白序列是３个菌株共有的分别为ＲｘＬＲ２４２－ｌ、逡逑ＲｘＬＲ２４２－２、ＲｘＬＲ２４２－３，，邋３邋种是邋ＬＴ２６３邋菌株中独有的分别为邋ＲｘＬＲ２４２－４、ＲｘＬＲ２４２－５、逡逑ＲｘＬＲ２４２－７
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.418.1;S435.651

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